1、 生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院 寧云山寧云山Protein(Native)Protein EngineeringBIOCHEMICALSTRUCTUR FOLDDING AgricultureAgriculture medicationA AP PPLIC CA AT TIO ONN非極性氨基酸 Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、 His、Tyr、Trp 不帶電荷的極性氨基酸 Ala、Val、Leu、Ile、 Phe、Pro、Met 帶正電荷的堿性氨基酸 Arg、Lys帶負(fù)電荷的酸性氨基酸 Asp、Glu分離混合氨基酸人胰島素的一級結(jié)構(gòu)人胰島素的一級結(jié)構(gòu)在平行（在平行（a）和反平行（）和反平

2、行（b）折疊片中氫鍵的排列折疊片中氫鍵的排列ABCA 胰島素的三級結(jié)構(gòu)胰島素的三級結(jié)構(gòu)B 溶菌酶分子的三級結(jié)構(gòu)溶菌酶分子的三級結(jié)構(gòu)C 磷酸丙糖異構(gòu)酶磷酸丙糖異構(gòu)酶C 丙酮酸激酶的三級結(jié)構(gòu)丙酮酸激酶的三級結(jié)構(gòu)D 組成蛋白質(zhì)的多條組成蛋白質(zhì)的多條肽鏈在天然構(gòu)象空間上肽鏈在天然構(gòu)象空間上的排列方式，多以弱鍵的排列方式，多以弱鍵互相連接，如疏水力、互相連接，如疏水力、氫鍵、鹽鍵。每條肽鏈氫鍵、鹽鍵。每條肽鏈本身具有一定的三級結(jié)本身具有一定的三級結(jié)構(gòu)，就是蛋白質(zhì)分子的構(gòu)，就是蛋白質(zhì)分子的亞基。亞基。亞基亞基血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)亞基的立體排布亞基的立體排布l鹽鍵又稱鹽橋或離子鍵（ionic

3、 bond):正電荷與負(fù)電荷之間的一種靜電相互作用。l氫鍵(hydrogen bond) :多肽主鏈上的羰基氧和酰胺氫之間、側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水、主鏈肽基與側(cè)鏈或主鏈肽基與水之間形成。l疏水作用（hydrophobic interaction) :介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向與把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)方面占有突出地位。l范德華力(van der waals force） ：指分子間的作用力。廣義上的范德華力包括3種較弱的作用力：定向效應(yīng)，誘導(dǎo)效應(yīng)，分散效應(yīng)。l二硫鍵（disulfide bond ）絕大多數(shù)情況下二硫鍵是在多肽鏈的轉(zhuǎn)角附近形成的 鹽鍵鹽鍵 氫鍵氫

4、鍵 疏水作用疏水作用 范德華力范德華力 二硫鍵二硫鍵 需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克幾十毫克）需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克幾十毫克） 蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同ELECTRON DENSITY MAPl物理、化學(xué)法物理、化學(xué)法生物化學(xué)法生物化學(xué)法基因重組技術(shù)基因重組技術(shù) 蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程 基基 因因 氨基酸氨基酸 多肽鏈多肽鏈 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄、翻譯轉(zhuǎn)錄、翻譯DNADNA合成合成生物學(xué)功能生物學(xué)功能生物學(xué)主流生物學(xué)主流 分離純化分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)的三維

5、結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系根據(jù)蛋一級結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)根據(jù)蛋一級結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物、克隆目的基因引物、克隆目的基因根據(jù)三維結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與根據(jù)三維結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及蛋白質(zhì)改功能的關(guān)系及蛋白質(zhì)改造的目的設(shè)計(jì)改造方案造的目的設(shè)計(jì)改造方案對目的基因?qū)δ康幕蚨c(diǎn)突變定點(diǎn)突變改造后的基改造后的基因在宿主細(xì)因在宿主細(xì)胞中表達(dá)胞中表達(dá)分離純化表分離純化表達(dá)的蛋白質(zhì)達(dá)的蛋白質(zhì) 分析分析 分析分析分析功能和評價(jià)分析功能和評價(jià)是否達(dá)到設(shè)計(jì)目的是否達(dá)到設(shè)計(jì)目的l人工合成帶突變位點(diǎn)的寡聚核人工合成帶突變位點(diǎn)的寡聚核苷酸作為引物苷酸作為引物l將待研究的基因插入載體將待研究的基因插入載體M13M13，制得單鏈模板，合成相

6、應(yīng)的互制得單鏈模板，合成相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，用補(bǔ)鏈，用T4T4連接酶連接成閉環(huán)連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。雙鏈分子。l經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯(cuò)配堿基種類型的噬菌斑，含錯(cuò)配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。l經(jīng)此擴(kuò)增出來的基因有經(jīng)此擴(kuò)增出來的基因有1/21/2是突是突變了的基因，經(jīng)一定的篩選便變了的基因，經(jīng)一定的篩選便可獲得突變基因?？色@得突變基因。l利用兩個(gè)互補(bǔ)的帶有突變堿利用兩個(gè)互補(bǔ)的帶有突變堿基的內(nèi)側(cè)引物及兩個(gè)外側(cè)引基的內(nèi)側(cè)引

7、物及兩個(gè)外側(cè)引物，先進(jìn)行兩次物，先進(jìn)行兩次PCRPCR擴(kuò)增，獲擴(kuò)增，獲得兩條彼此重疊的得兩條彼此重疊的DNADNA片段。片段。l兩條片段由于具有重疊區(qū)，兩條片段由于具有重疊區(qū)，因此在體外變性和復(fù)性后可因此在體外變性和復(fù)性后可形成兩種不同的異源雙鏈形成兩種不同的異源雙鏈DNADNA分子，其中一種帶有分子，其中一種帶有凹凹險(xiǎn)末端的險(xiǎn)末端的DNADNA可通過可通過TaqTaq酶延酶延伸而形成帶有突變位點(diǎn)的全伸而形成帶有突變位點(diǎn)的全長基因。長基因。l該基因再利用兩個(gè)外側(cè)引物該基因再利用兩個(gè)外側(cè)引物進(jìn)行第三次進(jìn)行第三次PCRPCR擴(kuò)增，便可獲擴(kuò)增，便可獲得人工定點(diǎn)突變的基因。得人工定點(diǎn)突變的基因。PCR

8、多次循環(huán)多次循環(huán)PCRPCRPCR35533535大引物大引物l19851985年年WellsWells提出提出l一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生2020種不同氨基酸的突變體，可以種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行行“飽和性飽和性”分析。分析。l利用定位突變在擬改造的氨基利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側(cè)造成兩個(gè)原載體和酸密碼兩側(cè)造成兩個(gè)原載體和基因上沒有的內(nèi)切酶切點(diǎn)，用基因上沒有的內(nèi)切酶切點(diǎn)，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈的發(fā)生不同變化的雙鏈DNADNA片段片段替代被消化的部分。替代被消化的部分。l一次處理就可以得到多種突變一次處理就可以得到多種突變型基因。型基因。 l核苷酸間磷酸基的氧被硫替代核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（后修飾物（S S）dCTPdCTP）對某些內(nèi)切酶有耐性，在有引對某些內(nèi)切酶有耐性，在有引物和（物和（S S）dCTPdCTP）存在）存在下合成負(fù)鏈，然后用內(nèi)切酶處下合成負(fù)鏈，然后用內(nèi)切酶處理，結(jié)果僅在正鏈上產(chǎn)生理，結(jié)