1、1.1.動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展史2.2.動物細(xì)胞的特征3.3.培養(yǎng)基4.4.動物細(xì)胞的獲得與保存5.5.動物細(xì)胞培養(yǎng)方法6.6.動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器7.7.動物細(xì)胞培養(yǎng)過程參數(shù)的控制與檢測動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展史1 1、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立 19071907年，年，Harrison首先培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)管區(qū)細(xì)胞，首先培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)管區(qū)細(xì)胞，并觀察到從中長出的軸突細(xì)胞（神經(jīng)纖維），他并觀察到從中長出的軸突細(xì)胞（神經(jīng)纖維），他的工作被認(rèn)為是動物細(xì)胞培養(yǎng)開始的標(biāo)志；的工作被認(rèn)為是動物細(xì)胞培養(yǎng)開始的標(biāo)志； 19111911年，年，Carrel發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對于培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)

2、了雞胚浸出液對于培養(yǎng)細(xì)胞的生長促進(jìn)作用，并首次把無菌技術(shù)引入組織培的生長促進(jìn)作用，并首次把無菌技術(shù)引入組織培養(yǎng)技術(shù)中。養(yǎng)技術(shù)中。 19141914年，年，Thomson建立了器官培養(yǎng)技術(shù)。建立了器官培養(yǎng)技術(shù)。 19401940年，年，1951年，年，Earle和和Gay分別建立了分別建立了c3H小小鼠結(jié)締組織細(xì)胞系的鼠結(jié)締組織細(xì)胞系的L系和人體細(xì)胞系人體宮頸系和人體細(xì)胞系人體宮頸癌癌Hela細(xì)胞系。細(xì)胞系。動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展史2 2、細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 1919世紀(jì)世紀(jì)30年代，年代，Muller, Schwann, Virchow等相繼等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病

3、理組織中觀察到在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到多核細(xì)胞現(xiàn)象；多核細(xì)胞現(xiàn)象； 18491849年年Lobing在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在；在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在； 18551855年年1858年，科學(xué)家們在肺組織和各種正常年，科學(xué)家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞；組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞； 18591859年，年，A. Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個細(xì)胞核融合形成多核的原生質(zhì)些黏蟲存在著由單個細(xì)胞核融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。團(tuán)的情況。 據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞是由單個細(xì)胞彼此融合而

4、據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞是由單個細(xì)胞彼此融合而形成的。至此，自然界中廣泛存在著多核細(xì)胞的事形成的。至此，自然界中廣泛存在著多核細(xì)胞的事實(shí)，才被生命科學(xué)工作者接受實(shí)，才被生命科學(xué)工作者接受。動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展史3 3、細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生、細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生 19581958年年, Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活仙臺病毒可引起艾氏發(fā)現(xiàn)紫外滅活仙臺病毒可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。腹水瘤細(xì)胞彼此融合。 6060年代，年代，Harris(1965)誘導(dǎo)不同動物體細(xì)胞融合獲誘導(dǎo)不同動物體細(xì)胞融合獲得成功并培養(yǎng)存活。得成功并培養(yǎng)存活。 19751975年，免疫學(xué)家年，免疫學(xué)家Koh

5、ler和和Milstein利用仙臺病毒利用仙臺病毒誘導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)誘導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。該雜胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。該雜種細(xì)胞具有在小鼠體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下大量繁殖種細(xì)胞具有在小鼠體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下大量繁殖的能力，并能長期地分泌單克隆抗體，從而建立了的能力，并能長期地分泌單克隆抗體，從而建立了小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。 動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展史4 4、動物克隆技術(shù)的建立、動物克隆技術(shù)的建立 首例克隆動物成功的報道是在首例克隆動物成功的報道是在1962年，英國學(xué)者年，英國

6、學(xué)者Grudon把把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵卵(經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核)中，約有中，約有1的重組卵發(fā)育成的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。為成熟蛙。 這一成功開創(chuàng)了由體細(xì)胞培育動物個體的新型實(shí)驗(yàn)途徑，這一成功開創(chuàng)了由體細(xì)胞培育動物個體的新型實(shí)驗(yàn)途徑，其貢獻(xiàn)在于：實(shí)驗(yàn)證明了完全分化的腸細(xì)胞仍然具有未分化其貢獻(xiàn)在于：實(shí)驗(yàn)證明了完全分化的腸細(xì)胞仍然具有未分化細(xì)胞的全部遺傳信息，并能在一定的條件下發(fā)育成動物個體，細(xì)胞的全部遺傳信息，并能在一定的條件下發(fā)育成動物個體，從而證明了動物細(xì)胞仍然具有全能性；初步建

7、立了體細(xì)胞核從而證明了動物細(xì)胞仍然具有全能性；初步建立了體細(xì)胞核移植的實(shí)驗(yàn)體系，證明在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育方向的早期，移植的實(shí)驗(yàn)體系，證明在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育方向的早期，卵細(xì)胞質(zhì)對體細(xì)胞核的發(fā)育功能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其卵細(xì)胞質(zhì)對體細(xì)胞核的發(fā)育功能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其作用因子可能是細(xì)胞質(zhì)中的作用因子可能是細(xì)胞質(zhì)中的mRNA與有關(guān)的蛋白質(zhì)與有關(guān)的蛋白質(zhì)。動物細(xì)胞的特征1.結(jié)構(gòu)特征與微生物相比，動物細(xì)胞體積較大，對環(huán)境因素敏感，營養(yǎng)需求高，倍增時間長，沒有細(xì)胞壁但對損傷更敏感。動物細(xì)胞的特征細(xì)胞膜動物細(xì)胞的特征2.動物細(xì)胞的代謝特征在其培養(yǎng)過程中，葡萄糖和谷氨酸為主要營養(yǎng)物質(zhì)，乳酸和氨是主

8、要的代謝副產(chǎn)物葡萄糖的代謝途徑葡萄糖的代謝途徑 在人體內(nèi)，葡萄糖代謝除了無氧酵解途徑以外還有很多其他方式，在人體內(nèi)，葡萄糖代謝除了無氧酵解途徑以外還有很多其他方式，比如有氧氧化、磷酸戊糖途徑、糖原的合成與分解途徑、糖異生、比如有氧氧化、磷酸戊糖途徑、糖原的合成與分解途徑、糖異生、糖醛酸途徑等。糖醛酸途徑等。 （一）糖的有氧氧化途徑：（一）糖的有氧氧化途徑： 1.1.概念：葡萄糖在有氧條件下徹底氧化成水和二氧化碳的過程概念：葡萄糖在有氧條件下徹底氧化成水和二氧化碳的過程 2.2.過程過程 有氧氧化可分為兩個階段：有氧氧化可分為兩個階段： 第一階段：胞液反應(yīng)階段：從葡萄糖到丙酮酸，反應(yīng)過程同糖酵解

9、。第一階段：胞液反應(yīng)階段：從葡萄糖到丙酮酸，反應(yīng)過程同糖酵解。 糖酵解產(chǎn)物糖酵解產(chǎn)物NADH不用于還原丙酮酸生成乳酸，二者進(jìn)入線粒體氧不用于還原丙酮酸生成乳酸，二者進(jìn)入線粒體氧化。化。 第二階段：線粒體中的反應(yīng)階段：第二階段：線粒體中的反應(yīng)階段： （1 1）丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體氧化脫羧生成乙酰）丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體氧化脫羧生成乙酰CoA，是關(guān)鍵，是關(guān)鍵性的不可逆反應(yīng)。其特征是丙酮酸氧化釋放的能量以高能硫酯鍵的性的不可逆反應(yīng)。其特征是丙酮酸氧化釋放的能量以高能硫酯鍵的形式儲存于乙酰形式儲存于乙酰CoA中，這是進(jìn)入三羧酸循環(huán)的開端。中，這是進(jìn)入三羧酸循環(huán)的開端。 動物細(xì)胞的特征（2）三

10、羧酸循環(huán)：三羧酸循環(huán)是在線粒體內(nèi)進(jìn)行的一系列酶促連續(xù)反應(yīng)，）三羧酸循環(huán)：三羧酸循環(huán)是在線粒體內(nèi)進(jìn)行的一系列酶促連續(xù)反應(yīng)，從乙酰從乙酰CoA和草酰乙酸縮合成檸檬酸到草酰乙酸的再生，構(gòu)成一次循環(huán)和草酰乙酸縮合成檸檬酸到草酰乙酸的再生，構(gòu)成一次循環(huán)過程，其間共進(jìn)行四次脫氫，脫下的過程，其間共進(jìn)行四次脫氫，脫下的4對氫，經(jīng)氧化磷酸化生成對氫，經(jīng)氧化磷酸化生成H20和和ATP。2次脫羧產(chǎn)生次脫羧產(chǎn)生2分分CO2。 三羧酸循環(huán)的特點(diǎn)是：三羧酸循環(huán)的特點(diǎn)是： 從檸檬從檸檬酸的合成到酸的合成到-酮戊二酸的氧化階段為不可逆反應(yīng)，故整個循環(huán)是不可逆酮戊二酸的氧化階段為不可逆反應(yīng)，故整個循環(huán)是不可逆的；的； 在循環(huán)

11、轉(zhuǎn)運(yùn)時，其中每一成分既無凈分解，也無凈合成。但在循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)時，其中每一成分既無凈分解，也無凈合成。但如移去或增加某一成分，則將影響循環(huán)速度；如移去或增加某一成分，則將影響循環(huán)速度； 三羧酸循環(huán)氧化三羧酸循環(huán)氧化乙酰乙酰CoA的效率取決于草酰乙酸的濃度；的效率取決于草酰乙酸的濃度； 每次循環(huán)所產(chǎn)生的每次循環(huán)所產(chǎn)生的NADH和和FADH2都可通過與之密切聯(lián)系的呼吸鏈進(jìn)行氧化磷酸化以產(chǎn)生都可通過與之密切聯(lián)系的呼吸鏈進(jìn)行氧化磷酸化以產(chǎn)生ATP； 該循環(huán)的限速步驟是異檸檬酸脫氫酶催化的反應(yīng)，該酶是該循環(huán)的限速步驟是異檸檬酸脫氫酶催化的反應(yīng)，該酶是變構(gòu)酶，變構(gòu)酶，ADP是其激活劑，是其激活劑，ATP和和NA

12、DH是其抑制劑。是其抑制劑。 （2 2） （3）氧化磷酸化：線粒體內(nèi)膜上分布有緊密相連的兩種呼吸鏈，）氧化磷酸化：線粒體內(nèi)膜上分布有緊密相連的兩種呼吸鏈，即即NADH呼吸鏈和琥珀酸呼吸鏈。呼吸鏈的功能是把代謝物脫下的氫氧呼吸鏈和琥珀酸呼吸鏈。呼吸鏈的功能是把代謝物脫下的氫氧化成水，同時產(chǎn)生大量能量以驅(qū)動化成水，同時產(chǎn)生大量能量以驅(qū)動ATP合成。合成。1個分子的葡萄糖徹底氧化個分子的葡萄糖徹底氧化為為CO2和和H2O，可生成，可生成36或或38個分子的個分子的ATP。3 .3 .生理意義：有氧氧化是糖氧化提供能量的主要方式。生理意義：有氧氧化是糖氧化提供能量的主要方式。動物細(xì)胞的特征（二）磷酸戊

13、糖途徑：（二）磷酸戊糖途徑： 在胞漿中進(jìn)行，存在于肝臟、乳腺、紅細(xì)胞等組織。在胞漿中進(jìn)行，存在于肝臟、乳腺、紅細(xì)胞等組織。 生理意義：生理意義： 1.1.提供提供5-磷酸核糖，用于核苷酸和核酸的生物合成。磷酸核糖，用于核苷酸和核酸的生物合成。 2.2.提供提供NADPH，參與多種代謝反應(yīng)，維持谷胱甘肽的還原狀態(tài)等。，參與多種代謝反應(yīng)，維持谷胱甘肽的還原狀態(tài)等。 （三）糖原的合成分解途徑：（三）糖原的合成分解途徑： 糖原是動物體內(nèi)糖的儲存形式，是葡萄糖通過糖原是動物體內(nèi)糖的儲存形式，是葡萄糖通過-1，4糖苷鍵和糖苷鍵和-1，6糖苷鍵相連而成的糖苷鍵相連而成的具有高度分枝的聚合物。機(jī)體攝入的糖大部

14、分轉(zhuǎn)變成脂肪（甘油三酯）后儲存于脂肪組織具有高度分枝的聚合物。機(jī)體攝入的糖大部分轉(zhuǎn)變成脂肪（甘油三酯）后儲存于脂肪組織內(nèi)，只有一小部分以糖原形式儲存。糖原主要分為肝糖原和肌糖原，糖原是可以迅速動用內(nèi)，只有一小部分以糖原形式儲存。糖原主要分為肝糖原和肌糖原，糖原是可以迅速動用的葡萄糖儲備。的葡萄糖儲備。 糖原合成酶是糖原合成中的關(guān)鍵酶，受糖原合成酶是糖原合成中的關(guān)鍵酶，受G-6-P等多種因素調(diào)控。葡萄等多種因素調(diào)控。葡萄糖合成糖原是耗能的過程，合成糖合成糖原是耗能的過程，合成1分子糖原需要消耗分子糖原需要消耗2個個ATP。 肝臟存在葡萄糖肝臟存在葡萄糖-6-磷磷酸酶，可使肝糖原分解成葡萄糖補(bǔ)充血

15、糖。酸酶，可使肝糖原分解成葡萄糖補(bǔ)充血糖。 肌肉組織無葡萄糖肌肉組織無葡萄糖-6-磷酸酶，不能直接磷酸酶，不能直接分解成葡萄糖，肌糖原分解產(chǎn)能可供肌肉收縮需要。分解成葡萄糖，肌糖原分解產(chǎn)能可供肌肉收縮需要。 （四）糖異生：（四）糖異生： 1.1.概念：由非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程稱為糖異生。是體內(nèi)單糖生物合成的唯一途徑。概念：由非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程稱為糖異生。是體內(nèi)單糖生物合成的唯一途徑。 肝臟是糖異生的主要器官，長期饑餓、酸中毒時腎臟的異生作用增強(qiáng)。肝臟是糖異生的主要器官，長期饑餓、酸中毒時腎臟的異生作用增強(qiáng)。 2.2.過程：過程： 糖異生的途徑基本上是糖酵解的逆向過程，但不是完全可逆

16、過程。酵解過糖異生的途徑基本上是糖酵解的逆向過程，但不是完全可逆過程。酵解過程中三個關(guān)鍵酶催化的反應(yīng)是不可逆的，故需通過糖異生的程中三個關(guān)鍵酶催化的反應(yīng)是不可逆的，故需通過糖異生的4個關(guān)鍵酶（葡萄糖個關(guān)鍵酶（葡萄糖-6-磷酸酶、磷酸酶、果糖果糖-1，6-二磷酸酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶）繞過糖酵解的三個能障生二磷酸酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶）繞過糖酵解的三個能障生成葡萄糖。成葡萄糖。 3.生理意義：生理意義： 補(bǔ)充血糖，維持血糖水平恒定。補(bǔ)充血糖，維持血糖水平恒定。 防止乳酸中防止乳酸中毒。毒。 協(xié)助氨基酸代謝。協(xié)助氨基酸代謝。 動物細(xì)胞的特征（五）糖醛酸途徑：（五）糖

17、醛酸途徑： 生理意義：生理意義： 生成有活性的葡萄糖醛酸，生成有活性的葡萄糖醛酸，它是生物轉(zhuǎn)化中重要的結(jié)合劑；它是生物轉(zhuǎn)化中重要的結(jié)合劑； 葡萄糖醛酸還是蛋白聚糖的重要葡萄糖醛酸還是蛋白聚糖的重要組成成分，如硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素等。組成成分，如硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素等。動物細(xì)胞的特征細(xì)胞內(nèi)兩個主要的谷氨酰胺代謝酶是谷氨酰胺分解酶和谷氨酰胺合成酶，前者細(xì)胞內(nèi)兩個主要的谷氨酰胺代謝酶是谷氨酰胺分解酶和谷氨酰胺合成酶，前者將谷氨酰胺分解成谷氨酸和氨，后者將谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，人體不同組將谷氨酰胺分解成谷氨酸和氨，后者將谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，人體不同組織有不同的反應(yīng)方向。例如，在肌肉、

18、肝臟、大腦、肺和脂肪細(xì)胞，谷氨酰胺織有不同的反應(yīng)方向。例如，在肌肉、肝臟、大腦、肺和脂肪細(xì)胞，谷氨酰胺的合成反應(yīng)占明顯優(yōu)勢的合成反應(yīng)占明顯優(yōu)勢;而在腸細(xì)胞和免疫細(xì)胞而在腸細(xì)胞和免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞淋巴細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞)內(nèi)，谷氨內(nèi)，谷氨酰胺則被大量用來提供細(xì)胞能量和供應(yīng)細(xì)胞內(nèi)酰胺則被大量用來提供細(xì)胞能量和供應(yīng)細(xì)胞內(nèi)DNA和和RNA的合成。的合成。培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)必需的溶液必需的溶液平衡鹽水（平衡鹽水（BSS）：）：Hanks 液和液和Earle液是常用的液是常用的BSS基礎(chǔ)溶液?；A(chǔ)溶液。PH調(diào)整液：調(diào)整液：3.7%、5.6%、7.4%的的NaHCO3溶液、溶液、HEPES溶

19、液（二羥乙基溶液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸哌嗪乙烷磺酸）細(xì)胞細(xì)胞消化液消化液:胰蛋白酶胰蛋白酶溶液、溶液、EDTA溶液、溶液、膠原酶膠原酶溶液。溶液?？股厝芤海嚎股厝芤海?)青、青、鏈霉素鏈霉素，每毫升培養(yǎng)液含，每毫升培養(yǎng)液含100U青霉素青霉素和和100ug鏈霉素。鏈霉素。2)卡那霉素卡那霉素：終濃度為：終濃度為50ug/ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)液。3）制霉菌素制霉菌素：濃度：濃度25U/ml，小瓶分裝，每瓶一次用完。，小瓶分裝，每瓶一次用完。常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清分為常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清分為胎牛血清胎牛血清和犢牛血清，前者來源和犢牛血清，前者來源少，價格高

20、；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因?yàn)椴溉楹蟮男∨Ｑ逯锌赡芎懈鼜?fù)雜少，價格高；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因?yàn)椴溉楹蟮男∨Ｑ逯锌赡芎懈鼜?fù)雜的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸氨基酸、葡萄糖葡萄糖、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。白和球蛋白。氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有12種是細(xì)胞本身不合成的，必須由種是細(xì)胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液培養(yǎng)液提供。激素有胰島素、提供。激素有胰島素、生長激素生長激素和多種生長因子如和多種生長因子如表皮生長因子表皮生長因子、成

21、纖維細(xì)胞生長成纖維細(xì)胞生長因子因子、增殖刺激因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長因子、類胰島素生長因子(IGFl、IGF2)等。等。水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基成分。水解乳蛋白是成分。水解乳蛋白是乳白蛋白乳白蛋白的水解的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成05%溶液，微酸性。膠原是從動物真溶液，微酸性。膠原是從動物真皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長的作用。皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長的作用。培養(yǎng)基1.天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基主要取自動物體液或從動物組織分

22、離提取。其優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)成天然培養(yǎng)基主要取自動物體液或從動物組織分離提取。其優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果良好，缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，來源受限。天然培養(yǎng)基分豐富，培養(yǎng)效果良好，缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，來源受限。天然培養(yǎng)基/液的液的種類很多，包括生物性液體種類很多，包括生物性液體(如如血清血清);組織浸液組織浸液(如胚胎浸液如胚胎浸液);凝固劑凝固劑(如血如血漿漿)等。等。天然培養(yǎng)基的特點(diǎn)及存在的問題天然培養(yǎng)基的特點(diǎn)及存在的問題:組織培養(yǎng)技術(shù)建立的早期，體外培養(yǎng)細(xì)組織培養(yǎng)技術(shù)建立的早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基，如蛋白水解物、血清等。其優(yōu)點(diǎn)是含有豐富的胞都是利用天然培養(yǎng)基，如蛋白水解物、血清等。其優(yōu)點(diǎn)是含有豐

23、富的營養(yǎng)物質(zhì)及各種細(xì)胞生長因子、激素類物質(zhì)，滲透壓、營養(yǎng)物質(zhì)及各種細(xì)胞生長因子、激素類物質(zhì)，滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)等也與體內(nèi)環(huán)境相似，缺點(diǎn)是其為成分不明確的混合物，受其來源及法規(guī)等問題的限境相似，缺點(diǎn)是其為成分不明確的混合物，受其來源及法規(guī)等問題的限制，制作過程復(fù)雜，批次間差異大，并逐漸被合成培養(yǎng)基所取代。實(shí)際制，制作過程復(fù)雜，批次間差異大，并逐漸被合成培養(yǎng)基所取代。實(shí)際工作中往往將天然培養(yǎng)基與人工合成培養(yǎng)基結(jié)合使用。目前常見有水解工作中往往將天然培養(yǎng)基與人工合成培養(yǎng)基結(jié)合使用。目前常見有水解乳蛋白和新生牛血清。乳蛋白和新生牛血清。一般的天然培養(yǎng)基都是屬于不完全培養(yǎng)基。一般的天然培養(yǎng)基都是屬

24、于不完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基2.合成培養(yǎng)基1951年厄爾開發(fā)了供年厄爾開發(fā)了供動物細(xì)胞動物細(xì)胞體外生長的人工合成培養(yǎng)基體外生長的人工合成培養(yǎng)基(MEM)。合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，。合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對實(shí)驗(yàn)條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的便于對實(shí)驗(yàn)條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基成成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛

25、血分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。清。動物血清成分復(fù)雜，各種生物大小動物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合分子混合在一起，有些在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對成分至今尚未搞清楚。血清對細(xì)胞生長細(xì)胞生長很有效，但后期對培很有效，但后期對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質(zhì)量養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基不加動物血清，在不加動物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生中加入細(xì)胞生長有效因子，激素等。長有效因子，激

26、素等。培養(yǎng)基成分1細(xì)胞培養(yǎng)基組成及作用氨基酸組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對氨基酸的要求各異，但有幾組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細(xì)胞生長不良而死亡缺少谷氨酰胺時，細(xì)胞生長不良而死亡1 。必需氨基酸包括必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、谷氨酰胺、L-組氨酸、組氨酸、L-異亮氨酸、異亮氨酸、L-亮氨酸、亮

27、氨酸、L-賴賴氨酸、氨酸、L-蛋氨酸、蛋氨酸、L-苯丙氨酸、苯丙氨酸、L-蘇氨酸、蘇氨酸、L-色氨酸、色氨酸、L-纈氨酸等。纈氨酸等。維生素維持細(xì)胞生長的維持細(xì)胞生長的生物活性生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。在細(xì)物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源，但是許多培養(yǎng)基中添加了各種胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源，但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長。維生素以適合更多的細(xì)胞系生長。脂溶性維生素如：脂溶性維生素如：A、D、E、K。水溶性維生素如：水溶性維生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸泛酸、葉酸葉酸、生物素、生物素、C、煙酰煙

28、酰胺胺等。等。培養(yǎng)基許多維生素參與構(gòu)成各種酶的活性基團(tuán)的成分，沒有它們，許多維生素參與構(gòu)成各種酶的活性基團(tuán)的成分，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進(jìn)行。酶便沒有活性，代謝活動將無法進(jìn)行。VA是細(xì)胞合成是細(xì)胞合成糖蛋白糖蛋白時寡糖基的載體，對時寡糖基的載體，對上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞有重要有重要的維護(hù)作用。的維護(hù)作用。VD參與調(diào)節(jié)鈣的吸收。參與調(diào)節(jié)鈣的吸收。VE是抗氧劑，可防止是抗氧劑，可防止組成生物膜的組成生物膜的磷脂磷脂中中不飽和脂肪酸不飽和脂肪酸被氧化。被氧化。VK缺乏會引起缺乏會引起低凝血酶原及低凝血酶原及凝血凝血時間延長。時間延長。葉酸是合成葉酸是合成四氫葉酸四氫葉酸的重要原料，四氫葉酸

29、在的重要原料，四氫葉酸在核酸核酸的生物的生物合成和蛋白質(zhì)的生物合成過程中起重要作用。合成和蛋白質(zhì)的生物合成過程中起重要作用。生物素是一些特異生物素是一些特異羧化酶羧化酶的組成部分，參與的組成部分，參與糖代謝糖代謝和和脂肪脂肪酸酸的合成過程。的合成過程。碳水化合物碳水化合物是細(xì)胞生長主要能量來源，其中有的是碳水化合物是細(xì)胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋合成蛋白質(zhì)白質(zhì)和和核酸核酸的成分。主要有的成分。主要有葡萄糖葡萄糖、核糖核糖、脫氧核糖脫氧核糖、丙酮丙酮酸鈉酸鈉和和醋酸醋酸等等。培養(yǎng)基無機(jī)離子鈉、鉀、鎂、鈣、磷等基本的鈉、鉀、鎂、鈣、磷等基本的無機(jī)離子無機(jī)離子，這些都是細(xì)胞組成所必須并參，這

30、些都是細(xì)胞組成所必須并參與細(xì)胞的代謝。與細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓滲透壓平衡。此外，通過提平衡。此外，通過提供鈉，鉀和供鈉，鉀和鈣離子鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素非常重要的因素, 細(xì)胞通?？赡褪芗?xì)胞通常可耐受260mOsm/kg 320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)

31、。有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。Na+是是細(xì)胞外液細(xì)胞外液中最主要的陽離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作中最主要的陽離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用。用。K+主要分布在主要分布在細(xì)胞內(nèi)液細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)K +的對于激活某些酶是必需的，的對于激活某些酶是必需的，它在調(diào)節(jié)它在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的的酸堿平衡酸堿平衡也有極重要意義。也有極重要意義。Ca2+ 在細(xì)胞外液中在細(xì)胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞生理活動，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。生理活動

32、，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。Mg2+ 是構(gòu)成是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞間質(zhì)的重的重要成分，對于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對細(xì)胞要成分，對于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對細(xì)胞物質(zhì)代謝物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控的功用是十分廣泛而不可缺少和生理功能調(diào)控的功用是十分廣泛而不可缺少。培養(yǎng)基2細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展趨勢無血清培養(yǎng)基用來在無血清條件下促使特殊類型的細(xì)胞生長或進(jìn)行專門應(yīng)用來在無血清條件下促使特殊類型的細(xì)胞生長或進(jìn)行專門應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要添加生長因子和用的培養(yǎng)基。需要添加生長因子和/或細(xì)胞因子，含有個別或細(xì)胞因子，含有個別蛋白或大量蛋白組分。其主要優(yōu)點(diǎn)：蛋白或大量蛋白組分。其主要

33、優(yōu)點(diǎn)：(1)增加確定性增加確定性;(2)性能更一致性能更一致;(3)容易進(jìn)行純化和下游加工容易進(jìn)行純化和下游加工;(4)提高制品安全性和提高制品安全性和/或產(chǎn)量?；虍a(chǎn)量。成分激素 生長因子 蛋白 貼壁和擴(kuò)展因子 脂質(zhì) 其他營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)基中沒有添加蛋白，但仍然可能包含一些動物或植物來源的成分培養(yǎng)基中沒有添加蛋白，但仍然可能包含一些動物或植物來源的成分(如低分子量肽的各種水解物如低分子量肽的各種水解物)化學(xué)限定培養(yǎng)基培養(yǎng)基中不包含有蛋白、培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)?；蛭粗Y(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)基的品

34、質(zhì)鑒定培養(yǎng)基的品質(zhì)鑒定外觀外觀顏色、粉末細(xì)度須均勻。顏色、粉末細(xì)度須均勻。溶解性溶解性培養(yǎng)基完全溶解，可以避免培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分的流失。培養(yǎng)基完全溶解，可以避免培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分的流失。pH值值哺乳類動物細(xì)胞生長需要合適的哺乳類動物細(xì)胞生長需要合適的酸堿度酸堿度，同時，同時pH值的測定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異。值的測定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異。水分水分培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份很豐富，利于微生物的滋長，因此水分的含量控制可以延長有效期。培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份很豐富，利于微生物的滋長，因此水分的含量控制可以延長有效期。冰點(diǎn)冰點(diǎn)滲透壓滲透壓細(xì)胞必須生活在合適的滲透壓環(huán)境中細(xì)胞必須生活在合適的滲透壓環(huán)境中;同時滲透

35、壓值的測定也可以檢查同時滲透壓值的測定也可以檢查培養(yǎng)基培養(yǎng)基的批間差異。的批間差異。菌落總數(shù)菌落總數(shù)粉末培養(yǎng)基不是粉末培養(yǎng)基不是無菌制劑無菌制劑，培養(yǎng)基本身的營養(yǎng)成分很豐富，容易滋生微生物，因此，培養(yǎng)基本身的營養(yǎng)成分很豐富，容易滋生微生物，因此菌落菌落的控制可以延的控制可以延長有效期長有效期細(xì)胞生長試驗(yàn)細(xì)胞生長試驗(yàn)可檢查細(xì)胞培養(yǎng)基是否有促生長的能力，以及是否有不利細(xì)胞生長的毒素?？蓹z查細(xì)胞培養(yǎng)基是否有促生長的能力，以及是否有不利細(xì)胞生長的毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素為滿足生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制要求，作為生物制品生產(chǎn)原料的培養(yǎng)基同樣需要細(xì)菌內(nèi)毒素控制。為滿足生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制要求，作為生物

36、制品生產(chǎn)原料的培養(yǎng)基同樣需要細(xì)菌內(nèi)毒素控制。穩(wěn)定性穩(wěn)定性確定產(chǎn)品的儲存、運(yùn)輸條件，產(chǎn)品的保質(zhì)期限。確定產(chǎn)品的儲存、運(yùn)輸條件，產(chǎn)品的保質(zhì)期限。一致性一致性動物細(xì)胞系的獲得與保存原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細(xì)胞系（原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細(xì)胞系（Cell Line），因此細(xì)胞系可），因此細(xì)胞系可泛指一般可能傳代的細(xì)胞。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或泛指一般可能傳代的細(xì)胞。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有無限細(xì)胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。限細(xì)胞系。一般采用細(xì)胞凍存，利用凍存技術(shù)將

37、細(xì)胞置于一般采用細(xì)胞凍存，利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196液氮中低溫保存，液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。時候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑-終濃度終濃度515的甘油或二甲基亞砜的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩，可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。 采用采用慢凍快融慢凍快融

38、的方法能較好地保證細(xì)胞存活。的方法能較好地保證細(xì)胞存活。 若細(xì)胞只需要暫時保存，則可用懸浮培養(yǎng)，但要維持細(xì)胞的貼壁狀態(tài)，若細(xì)胞只需要暫時保存，則可用懸浮培養(yǎng)，但要維持細(xì)胞的貼壁狀態(tài)，盡量不出現(xiàn)接觸抑制盡量不出現(xiàn)接觸抑制動物細(xì)胞培養(yǎng)方法貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)(attachment culture)是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)培養(yǎng)。貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)(瓶瓶)器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。

39、一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。容易更換培養(yǎng)液容易更換培養(yǎng)液;細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。后直接加入新培養(yǎng)液。容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的;因細(xì)胞固定表面，因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。不需過濾系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。細(xì)胞的比例。適用

40、于所有類型細(xì)胞。適用于所有類型細(xì)胞。3. 3. 貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn):與懸浮培養(yǎng)法相比與懸浮培養(yǎng)法相比擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大;占地面積大占地面積大;不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長; 動物細(xì)胞培養(yǎng)方法細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中生長或維持。某些貼壁依賴性細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)和選擇細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中生長或維持。某些貼壁依賴性細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)和選擇也可用此方法培養(yǎng)。增加懸浮培養(yǎng)規(guī)模相對比較簡單，只要增加體積就也可用此方法培養(yǎng)。增加懸浮培養(yǎng)規(guī)模相對比較簡單，只要增加體積就可以了。深度超過可以了。深度超過5mm，需要攪動培養(yǎng)基，超過，需要攪動培養(yǎng)基，超過10cm，還需要深層通，

41、還需要深層通入入CO2和空氣，以保證足夠的氣體交換。通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細(xì)胞始和空氣，以保證足夠的氣體交換。通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細(xì)胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法。終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法。非貼壁依賴性細(xì)胞的一種非貼壁依賴性細(xì)胞的一種培養(yǎng)培養(yǎng)方式。方式。在液體懸浮在液體懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)過程中應(yīng)注意及時進(jìn)行細(xì)胞過程中應(yīng)注意及時進(jìn)行細(xì)胞繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)，因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)物生，因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)物生長到一定時期將進(jìn)入分裂的長到一定時期將進(jìn)入分裂的靜止期靜止期。對于多數(shù)懸浮培養(yǎng)物來說，細(xì)胞在。對于多數(shù)懸浮培養(yǎng)物來說，細(xì)胞在培養(yǎng)到第培養(yǎng)到第1825d 時達(dá)到最大的密度，此時應(yīng)進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)。在時達(dá)到最

42、大的密度，此時應(yīng)進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)時，應(yīng)將較大的細(xì)胞團(tuán)塊和繼代培養(yǎng)時，應(yīng)將較大的細(xì)胞團(tuán)塊和接種物接種物殘渣除去。若從植物器官或殘渣除去。若從植物器官或組織開始建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，就包括愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、組織開始建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，就包括愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、單細(xì)胞分離和懸浮培養(yǎng)。單細(xì)胞分離和懸浮培養(yǎng)。微載體培養(yǎng)：以細(xì)小的顆粒作為細(xì)胞載體，通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，微載體培養(yǎng)：以細(xì)小的顆粒作為細(xì)胞載體，通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，使細(xì)胞在載體表面繁殖成單層的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。使細(xì)胞在載體表面繁殖成單層的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。 一、一、微囊法微囊法（microencapsulat

43、ionmicroencapsulation）: : 用一層用一層親水的半透膜親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長好、密度高。細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長好、密度高。 動物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)動物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)微膠囊膜微膠囊膜生物大分子生物大分子代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物細(xì)胞細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器動物細(xì)胞體外培養(yǎng)時，生物反應(yīng)器是整個培養(yǎng)過程的關(guān)鍵設(shè)

44、備，為細(xì)胞動物細(xì)胞體外培養(yǎng)時，生物反應(yīng)器是整個培養(yǎng)過程的關(guān)鍵設(shè)備，為細(xì)胞提供了一個適宜的生長環(huán)境，使之快速增殖并形成所需的生物組織制品。提供了一個適宜的生長環(huán)境，使之快速增殖并形成所需的生物組織制品。由于動物細(xì)胞在其形態(tài)結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)方法以及所需的力學(xué)環(huán)境等方面均不由于動物細(xì)胞在其形態(tài)結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)方法以及所需的力學(xué)環(huán)境等方面均不同于微生物細(xì)胞，因而傳統(tǒng)的微生物反應(yīng)器顯然已不適用于動物細(xì)胞大同于微生物細(xì)胞，因而傳統(tǒng)的微生物反應(yīng)器顯然已不適用于動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，特別是組織工程的需要，促使新型生物反應(yīng)器的研究與開發(fā)規(guī)模培養(yǎng)，特別是組織工程的需要，促使新型生物反應(yīng)器的研究與開發(fā)。攪拌式生物反應(yīng)器 攪拌式反

45、應(yīng)器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作范圍、良攪拌式反應(yīng)器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性，因此在生物反應(yīng)中被廣泛使用。但由于動物好的混合性和濃度均勻性，因此在生物反應(yīng)中被廣泛使用。但由于動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁的保護(hù)，因此對剪切作用十分敏感，直接的機(jī)械攪拌很細(xì)胞沒有細(xì)胞壁的保護(hù)，因此對剪切作用十分敏感，直接的機(jī)械攪拌很容易對其造成損害，傳統(tǒng)的用于微生物的攪拌反應(yīng)器用作動物細(xì)胞的培容易對其造成損害，傳統(tǒng)的用于微生物的攪拌反應(yīng)器用作動物細(xì)胞的培養(yǎng)顯然是不合適的。所以，動物細(xì)胞培養(yǎng)中的攪拌式反應(yīng)器都是經(jīng)過改養(yǎng)顯然是不合適的。所以，動物細(xì)胞培養(yǎng)中的攪拌式反應(yīng)

46、器都是經(jīng)過改進(jìn)的，包括改進(jìn)供氧方式、攪拌槳的形式及在反應(yīng)器內(nèi)加裝輔件等。進(jìn)的，包括改進(jìn)供氧方式、攪拌槳的形式及在反應(yīng)器內(nèi)加裝輔件等。動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器供氧方式的改進(jìn)一般情況下攪拌式反應(yīng)器還常伴有鼓泡，為細(xì)胞生長提供所需氧分。由于動物一般情況下攪拌式反應(yīng)器還常伴有鼓泡，為細(xì)胞生長提供所需氧分。由于動物細(xì)胞對鼓泡的剪胞生長提供所需氧分。由于動物細(xì)胞對鼓泡的剪切也很敏感，細(xì)胞對鼓泡的剪胞生長提供所需氧分。由于動物細(xì)胞對鼓泡的剪切也很敏感，所以人們在供氧方式的改進(jìn)上做了許多工作。籠式供氧是攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)所以人們在供氧方式的改進(jìn)上做了許多工作。籠式供氧是攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)器供氧方式的一種，即氣泡

47、用絲網(wǎng)隔開，不與細(xì)胞直接接觸；反應(yīng)器既能保證器供氧方式的一種，即氣泡用絲網(wǎng)隔開，不與細(xì)胞直接接觸；反應(yīng)器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力，以滿足細(xì)胞生長的要求。北野昭一報道了一混合效果又有盡可能小的剪切力，以滿足細(xì)胞生長的要求。北野昭一報道了一個經(jīng)過改進(jìn)的攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)器，整體呈梨形，攪拌置于反應(yīng)器底部，在個經(jīng)過改進(jìn)的攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)器，整體呈梨形，攪拌置于反應(yīng)器底部，在攪拌軸外裝了一個錐形不銹鋼絲網(wǎng)與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動。軸心處的鼓泡管在絲網(wǎng)攪拌軸外裝了一個錐形不銹鋼絲網(wǎng)與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動。軸心處的鼓泡管在絲網(wǎng)內(nèi)側(cè)鼓泡，絲網(wǎng)外側(cè)的細(xì)胞不與氣泡直接接觸。內(nèi)側(cè)鼓泡，絲網(wǎng)外側(cè)的細(xì)胞不與氣泡直接接

48、觸。攪拌槳的改進(jìn)攪拌槳的形式對細(xì)胞生長的影響非常大，這方面的改進(jìn)主要考慮如何減小細(xì)胞攪拌槳的形式對細(xì)胞生長的影響非常大，這方面的改進(jìn)主要考慮如何減小細(xì)胞所受的剪切力。有人對攪拌槳的形式作了改進(jìn)，并在反應(yīng)器內(nèi)加裝了輔件，實(shí)所受的剪切力。有人對攪拌槳的形式作了改進(jìn)，并在反應(yīng)器內(nèi)加裝了輔件，實(shí)驗(yàn)證明改進(jìn)后的反應(yīng)器適用于對剪切力敏感的細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng)。反應(yīng)器采驗(yàn)證明改進(jìn)后的反應(yīng)器適用于對剪切力敏感的細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng)。反應(yīng)器采用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳，頂部的法蘭蓋上安裝了用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳，頂部的法蘭蓋上安裝了3塊表面擋板。每塊擋板相塊表面擋板。每塊擋板相對于徑向的夾角為對于徑向的夾角為30，

49、垂直插入液面。擋板的存在減小了液面上的旋渦。這個，垂直插入液面。擋板的存在減小了液面上的旋渦。這個反應(yīng)器維持了較小的剪切力，實(shí)驗(yàn)中用于昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)，最終的培養(yǎng)密度達(dá)反應(yīng)器維持了較小的剪切力，實(shí)驗(yàn)中用于昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)，最終的培養(yǎng)密度達(dá)到到6106個個/mL，成活率在，成活率在98%以上。以上。動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器非攪拌式生物反應(yīng)器折疊折疊攪拌式生物反應(yīng)器用于動物細(xì)胞培養(yǎng)存在的最大缺點(diǎn)是剪切力大，容易損傷細(xì)攪拌式生物反應(yīng)器用于動物細(xì)胞培養(yǎng)存在的最大缺點(diǎn)是剪切力大，容易損傷細(xì)胞，雖然經(jīng)過各種改進(jìn)，這個問題仍很難避免。相比之下，非攪拌式反應(yīng)器產(chǎn)胞，雖然經(jīng)過各種改進(jìn)，這個問題仍很難避免。相比之下，非攪拌式反應(yīng)器產(chǎn)生的剪切力較小，在動物細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢。生的剪切力較小，在動物細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢。（1）填充床反應(yīng)器填充是在反應(yīng)器中填充一定材質(zhì)的填充物，供細(xì)胞貼壁生長。）填充床反應(yīng)器填充是在反應(yīng)器中填充一定材質(zhì)的填充物，供細(xì)胞貼壁生長。營