1、實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞器的分離與觀察細(xì)胞器的分離與觀察細(xì)胞核的分離與觀察細(xì)胞核的分離與觀察線粒體的分離與觀察線粒體的分離與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膐了解細(xì)胞器的分離原理了解細(xì)胞器的分離原理o掌握差速離心和密度梯度離心技術(shù)掌握差速離心和密度梯度離心技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理o 細(xì)胞器是細(xì)胞中維持細(xì)胞復(fù)雜生命活動(dòng)的功能性器官，細(xì)胞器是細(xì)胞中維持細(xì)胞復(fù)雜生命活動(dòng)的功能性器官，為了研究各種細(xì)胞器的功能，首先就要將這些細(xì)胞器從為了研究各種細(xì)胞器的功能，首先就要將這些細(xì)胞器從細(xì)胞中分離出來。利用各種物理方法（研磨、超聲波振細(xì)胞中分離出來。利用各種物理方法（研磨、超聲波振蕩、低滲等將組織制成勻漿，細(xì)胞中的個(gè)中亞組分即

2、從蕩、低滲等將組織制成勻漿，細(xì)胞中的個(gè)中亞組分即從細(xì)胞中釋放出來。細(xì)胞中釋放出來。o 細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器大小密度存在差異，因此不同細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器大小密度存在差異，因此不同細(xì)胞器在介質(zhì)中的沉降系數(shù)各不相同。根據(jù)這一原理，細(xì)胞器在介質(zhì)中的沉降系數(shù)各不相同。根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法來分離不同的細(xì)胞器。分級分離常用不同轉(zhuǎn)速的離心法來分離不同的細(xì)胞器。分級分離的方法有差速離心和密度梯度離心兩種。的方法有差速離心和密度梯度離心兩種。o 分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其

3、過程包括組織法進(jìn)行分離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿細(xì)胞勻漿、分級分離分級分離和和分析分析三步，這種方法已成為三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。及其功能的主要手段。 (1)(1)勻漿勻漿(Homogenization)(Homogenization)低溫條件下，低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)質(zhì)( (即即0.25mol0.25molL L蔗糖蔗糖) )進(jìn)行破碎細(xì)胞使進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。 (2)(2)分級分離分級分離(

4、Fractionation)(Fractionation)由低速到高速由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、淀下來，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級離心得到的第一次沉個(gè)離心管中，所以每級離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮淀必然不是純的最重的

5、顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化和離心加以純化. . (3)(3)分析分析 分級分離得到的組分，可用細(xì)胞化分級分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。Unna染色法（甲基綠甲基綠- -派洛寧染色）派洛寧染色） 18991899年年P(guān)appenheimPappenheim 首創(chuàng)了甲基綠首創(chuàng)了甲基綠- -哌洛寧哌洛寧（mehtyl-green-pyronimmehtyl-green-pyronim）染色法。）染色法。19021902年年UnnaUnna對這一方法進(jìn)行了改良。對這一方法進(jìn)行了改良。19401940年年BrachetBrachet研究證

6、明用甲基綠研究證明用甲基綠哌洛寧對哌洛寧對DNADNA和和RNARNA有選有選擇性的染色效果。核酸是酸性的，它們對于擇性的染色效果。核酸是酸性的，它們對于堿性染料甲基綠和派洛寧的親和力不同，而堿性染料甲基綠和派洛寧的親和力不同，而使這兩種染料對兩類核酸具有了選擇性。使這兩種染料對兩類核酸具有了選擇性。DNADNA被甲基綠染成綠色，被甲基綠染成綠色，RNARNA被派洛寧染成紅色，被派洛寧染成紅色，這樣就能使細(xì)胞中兩種核酸分布顯示出來這樣就能使細(xì)胞中兩種核酸分布顯示出來 。 中性紅中性紅- -詹納斯綠染色詹納斯綠染色 詹納斯綠（詹納斯綠（JanusJanus green B green B）是對線

7、）是對線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。由于線粒體內(nèi)具引堆積在線粒體膜上。由于線粒體內(nèi)具有細(xì)胞色素氧化酶系，能使詹納斯綠保有細(xì)胞色素氧化酶系，能使詹納斯綠保持在氧化狀態(tài)（淡藍(lán)綠色），在胞質(zhì)區(qū)持在氧化狀態(tài)（淡藍(lán)綠色），在胞質(zhì)區(qū)詹納斯綠則被還原為無色。中性紅的陽詹納斯綠則被還原為無色。中性紅的陽離子可與帶有一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)離子可與帶有一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合，而使原生質(zhì)與細(xì)胞核染色。胞核結(jié)合，而使原生質(zhì)與細(xì)胞核染色。離心技術(shù)概述o 離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)

8、動(dòng)時(shí)都會(huì)離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)都會(huì)受到一個(gè)向外的力這一原理而發(fā)展起來的一種受到一個(gè)向外的力這一原理而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。分離技術(shù)。o 離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)受離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)受到一個(gè)向外的力。與角速度和旋轉(zhuǎn)半徑有關(guān)。到一個(gè)向外的力。與角速度和旋轉(zhuǎn)半徑有關(guān)。o 相對離心力又稱相對離心加速度，是指離心力相對離心力又稱相對離心加速度，是指離心力相當(dāng)于重力加速度的倍數(shù)，表示相當(dāng)于重力加速度的倍數(shù)，表示“數(shù)字?jǐn)?shù)字g”g”。離心力離心力g g1.111.111010-5-5n n2 2r r r r為離心機(jī)中軸到離心管遠(yuǎn)為離心機(jī)中軸到離心管遠(yuǎn)端的距離

9、端的距離 n n為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)速為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)速（r/minr/min） 1000g=9.81000g=9.8牛（牛（N N）離心技術(shù)類型離心技術(shù)類型o 離心技術(shù)可用于細(xì)胞器的分離。離心技術(shù)可用于細(xì)胞器的分離。o 離心技術(shù)一般包括：差速離心和密度梯度離離心技術(shù)一般包括：差速離心和密度梯度離心心（一）差速離心（一）差速離心（differential centrifugation）o 在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。o 差速離心法是指有低速到高速逐級沉淀分離，差速離心法是指有低速

10、到高速逐級沉淀分離，使較大的顆粒先在較低速中沉淀，再用較高的使較大的顆粒先在較低速中沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速將原先懸浮于上清夜中的較小顆粒分離沉轉(zhuǎn)速將原先懸浮于上清夜中的較小顆粒分離沉淀下來，從而使各種亞細(xì)胞組分得以分離。淀下來，從而使各種亞細(xì)胞組分得以分離。o 但由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離但由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心十是均勻分布于整個(gè)離心介質(zhì)中的，故每級心十是均勻分布于整個(gè)離心介質(zhì)中的，故每級分離得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆分離得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，需經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。粒，需經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。（二）密度梯度離心（二）密度梯度離心

11、（density gradient centrifugation） A A等速度沉降，等速度沉降，B B等密度沉降等密度沉降o 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。o 密度梯度離心法是用密度具有梯度的介質(zhì)來替密度梯度離心法是用密度具有梯度的介質(zhì)來替換離心管中的密度均一的介質(zhì)，使介質(zhì)分為不換離心管中的密度均一的介質(zhì)，使介質(zhì)分為不同的層次，濃度的低的在上層，濃度高的在底同的層次，濃

12、度的低的在上層，濃度高的在底層。將細(xì)胞勻漿加在最上層，隨后離心。這樣，層。將細(xì)胞勻漿加在最上層，隨后離心。這樣，不同大小、形態(tài)、密度的顆粒就會(huì)以不同的速不同大小、形態(tài)、密度的顆粒就會(huì)以不同的速度向下移動(dòng)，集中到不同的區(qū)域，可以分別收度向下移動(dòng)，集中到不同的區(qū)域，可以分別收集。集。o 細(xì)胞器分離過程中的懸浮介質(zhì)常使用水溶性的細(xì)胞器分離過程中的懸浮介質(zhì)常使用水溶性的蔗糖溶液，因?yàn)樗容^接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，蔗糖溶液，因?yàn)樗容^接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上，能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能，在一定程度上，能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能，保持酶的活性，避免細(xì)胞器的聚集。保持酶的活性，避免細(xì)胞器的聚集。 沉淀沉淀

13、轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速x x時(shí)間時(shí)間 內(nèi)內(nèi) 容容 物物 A A150g x 20min150g x 20min完整細(xì)胞完整細(xì)胞 B B1000g x 20min 1000g x 20min 細(xì)胞核，細(xì)胞碎片細(xì)胞核，細(xì)胞碎片C C3000g x 6min 3000g x 6min 葉綠體葉綠體 D D10000g x20min 10000g x20min 線粒體、溶酶體、微體線粒體、溶酶體、微體 E E105000g x120min105000g x120min微粒體微粒體 F F105000g x 20min 105000g x 20min 0.26%脫氧膽酸納脫氧膽酸納 核糖體核糖體 三、材料和試劑o 材

14、料：小鼠的肝臟材料：小鼠的肝臟o 器材：高速冷凍離心機(jī)、天平、顯微鏡、吸管、器材：高速冷凍離心機(jī)、天平、顯微鏡、吸管、EppendorfEppendorf管、冰塊、冰盒、載玻片、蓋玻片、燒杯、管、冰塊、冰盒、載玻片、蓋玻片、燒杯、玻璃勻漿器玻璃勻漿器o 試劑：生理鹽水、試劑：生理鹽水、0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液、蔗糖溶液、 0.34mol/L0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液-0.5mmol/Mg-0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶液、溶液、0.88mol/L0.88mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液-0.5mmol/Mg-0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶液、溶液、

15、 95%95%乙醇溶液、丙酮、乙醇溶液、丙酮、PBSPBS液、液、 甲基綠甲基綠- -派洛寧染液、中性紅派洛寧染液、中性紅- -詹納斯綠染液。詹納斯綠染液。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1.1.細(xì)胞核的分離細(xì)胞核的分離o （1 1）組織勻漿）組織勻漿: :將饑餓將饑餓24h24h的大白鼠處死的大白鼠處死, ,立即剪開腹立即剪開腹部部, ,迅速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水迅速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水, ,洗去血污洗去血污, ,用用濾紙吸干。稱取濾紙吸干。稱取0.5g0.5g肝組織肝組織, ,在小燒杯中剪碎在小燒杯中剪碎, ,用預(yù)冷用預(yù)冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。將燒杯中的

16、懸浮肝組蔗糖溶液洗滌數(shù)次。將燒杯中的懸浮肝組織倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿織倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿, ,勻漿過程要在冰浴中進(jìn)行。勻漿過程要在冰浴中進(jìn)行。勻漿完畢勻漿完畢, ,移入移入1.5ml1.5ml離心管中。離心管中。o （2 2）離心：低溫離心機(jī)中進(jìn)行。）離心：低溫離心機(jī)中進(jìn)行。 每次離心前每次離心前一定要在天平（一定要在天平（托盤天平托盤天平）上將兩離心管配平。）上將兩離心管配平。第一次以第一次以600g600g離心離心10min10min。將其上清夜移入。將其上清夜移入EppendorfEppendorf管中，蓋好蓋子置于冰浴中，留待后管中，蓋好蓋子置于冰浴中，留待后面使用面使用( (分離線粒

17、體分離線粒體) )。沉淀使用。沉淀使用1ml1ml預(yù)冷的預(yù)冷的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液離心洗滌蔗糖溶液離心洗滌2 2次，每次次，每次1000g1000g離離心心10min10min。o （3 3）純化：將沉淀用）純化：將沉淀用5 5倍體積倍體積0.34mol/L0.34mol/L蔗糖溶蔗糖溶液液-0.5mmol/Mg-0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶液混懸，用長針頭注射溶液混懸，用長針頭注射器再混懸液下輕輕加入器再混懸液下輕輕加入4 4倍體積倍體積0.88mol/L0.88mol/L蔗糖溶蔗糖溶液液-0.5mmol/Mg-0.5mmol/Mg（Ac)Ac)2 2溶

18、液。盡量使兩種溶液明溶液。盡量使兩種溶液明顯分層。以顯分層。以1500g1500g離心離心151520min20min。棄上清液，沉。棄上清液，沉淀即為經(jīng)過純化的細(xì)胞核，用淀即為經(jīng)過純化的細(xì)胞核，用PBSPBS溶液懸浮，溶液懸浮，4 4C C保存。保存。o （4 4）鑒定：將分離純化的細(xì)胞核制成涂片，空氣）鑒定：將分離純化的細(xì)胞核制成涂片，空氣干燥。將干燥的涂片浸入干燥。將干燥的涂片浸入9595乙醇溶液固定乙醇溶液固定5min5min，晾干，滴加甲基綠晾干，滴加甲基綠- -派洛寧染液染色派洛寧染液染色202030min30min，丙丙酮分色酮分色30 s30 s，蒸餾水漂洗，濾紙吸干水，鏡檢。，蒸餾水漂洗，濾紙吸干水，鏡檢。核核DNADNA呈藍(lán)綠色，核仁和混雜的細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)綠色，核仁和混雜的細(xì)胞質(zhì)RNARNA呈紅色。呈紅色。2.2.線粒體的分離線粒體的分離o (1)(1)分離分離: :將分離細(xì)胞核時(shí)收集的上清液以將分離細(xì)胞核時(shí)收集的上清液以10000g10000g離心離心10min10min。沉淀用預(yù)冷。沉淀用預(yù)冷0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液懸蔗糖溶液懸浮浮,10000g,10000g離心離心10min,10min,反復(fù)反復(fù)2 2次。次。o (2)(2)鑒定鑒定: :