1、 分子生態(tài)學是應用分子生物學的原理和方法來研究生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)相互作用的生態(tài)機理及其分子機制的科學。它是生態(tài)學與分子生物學相互滲透的形成的一門新興交叉學科，其研究內(nèi)容包括種群在分子水平的遺傳多樣性及遺傳結構，生物器官變異的分子機制，生物體內(nèi)有機大分子對環(huán)境因子變化的響應，生物大分子結構、功能演變與環(huán)境長期變化的關系以及其他生命層次生態(tài)現(xiàn)象的分子機理等。 微生物群落結構和多樣性是微生物生態(tài)學微生物群落結構和多樣性是微生物生態(tài)學研究的熱點內(nèi)容。研究的熱點內(nèi)容。p群落結構決定了生態(tài)功能的特性和強弱。p群落結構的高穩(wěn)定性是實現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素。p群落結構變化是標記環(huán)境變化的重要方面。通過對環(huán)境微生

2、物群落結構和多樣性進行解析并研究其動態(tài)變化，可以為調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供可靠的依據(jù)。 20世紀70年代以前：傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，依靠形態(tài)學、培養(yǎng)特征、生理生化特性的比較進行分類鑒定和計數(shù)，認識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。微生物群落結構和多樣性研究方法：微生物群落結構和多樣性研究方法： 在70和80年代：對微生物化學成分的分析，建立了一些微生物分類和定量的方法（生物標記物方法），對環(huán)境微生物群落結構及多樣性的認識進入到較客觀的層次上。在80和90年代：現(xiàn)代分子生物學技術以DNA為目標物，通過rRNA基因測序技術和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺

3、傳的多樣性，并給出了關于群落結構的直觀信息。雖然可以檢測環(huán)境中的活細胞，并且對微生物生態(tài)學的發(fā)展起了很重要的作用。采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少 （不到1 % ）。Amann 等人報道在自然環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的微生物占總的微生物數(shù)量的比例范圍從0.001%（海水）到0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物區(qū)系組成狀況，煩瑣、耗時。1、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法微生物不可培養(yǎng)的原因微生物不可培養(yǎng)的原因 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 營養(yǎng)限制營養(yǎng)限制 失去生態(tài)位失去生態(tài)位 2、群落水平生理學指紋方法、群

4、落水平生理學指紋方法(CLPP)微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標記分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理學指紋方法(CLPP)，通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性的分析方法。具體而言，CLPP就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源的利用能力，來確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生對基質(zhì)利用的生理代謝指紋。 自動化、快速自動化、快速 可鑒定細菌有可鑒定細菌有11401140多多種、酵母菌種、酵母菌267267種、目前種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。已經(jīng)

5、可用于絲狀真菌。每個孔中含有每個孔中含有不同的底物不同的底物菌懸液或菌懸液或無菌水無菌水 生物標記物通常是微生物細胞的生化組成成分，其總量通常與相應生物量呈正相關。 特定的標記物標志著特定的微生物，一些生物標記物的組成模式(種類、數(shù)量和相對比例)可作為指紋估價微生物群落結構。 首先使用一種合適的提取劑直接把生物標記物從環(huán)境中提取出來，然后對提取物進行純化，后用合適的儀器加以定量測定。優(yōu)點：不需要把微生物的細胞從環(huán)境樣中分離，能克服由于培養(yǎng)而導致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。醌指紋法醌指紋法(Quinones Profiling) 磷脂是構成生物細胞膜的主要成分，約占細胞干重的5%。在細胞

6、死亡時，細胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細胞中存在，十分適合于微生物群落的動態(tài)監(jiān)測。磷脂脂肪酸（磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪）、甲基脂肪酸酯（酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）譜圖分析）譜圖分析 脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。 甲基脂肪酸酯是細胞膜磷脂水解產(chǎn)物，氣相色譜分析系統(tǒng)分析出全細胞的FAME譜圖。 磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。 PLFA方法適合跟蹤研究微生物群落的動態(tài)方法適合跟蹤研究

7、微生物群落的動態(tài)變化變化,能夠快速有效的從環(huán)境樣品種提取大部分脂能夠快速有效的從環(huán)境樣品種提取大部分脂肪酸肪酸,但是也有其局限性。但是也有其局限性。 第一第一,他不能從種的水品上鑒定微生物他不能從種的水品上鑒定微生物,只能只能鑒定到屬鑒定到屬; 第二第二,這種方法強烈的依賴于標記脂肪酸這種方法強烈的依賴于標記脂肪酸,標標記脂肪酸變化導致錯誤的群落變化估計記脂肪酸變化導致錯誤的群落變化估計,因此操作因此操作過程需要十分謹慎過程需要十分謹慎,防止人為因素的干擾。防止人為因素的干擾。 第三第三,細菌和真菌在不同的生長時期以及環(huán)境細菌和真菌在不同的生長時期以及環(huán)境壓力下的脂肪酸含量有所變化壓力下的脂肪

8、酸含量有所變化,給監(jiān)測帶來困難。給監(jiān)測帶來困難。 另外，不同微生物種屬之間脂肪酸組成有重另外，不同微生物種屬之間脂肪酸組成有重疊，外來生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對種群疊，外來生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對種群結構解析的可靠性。結構解析的可靠性。 Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6種純菌組成的混合菌的組成，獲得了高重復性的指紋圖譜，比常規(guī)RAPD-PCR相比更能反映菌群的組成特征。 在微生物群落中，各細菌數(shù)量占1-10%時，其特征性ERIC-PCR主條帶就可以在指紋圖中表現(xiàn)出來。ERIC-PCR指紋圖中，每一條帶可以是來自若干種不同微生物的基因組DNA片段，條帶的數(shù)目反映微生物

9、類群的多少，條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低。 分析不同環(huán)境樣品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指紋圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個群落在不同功能狀態(tài)下的結構變化。E1: 5-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3E2: 5-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3ERIC-PCR引物20 pmol/l 5. 以以PCR為基礎的為基礎的rRNA及及rDNA的分析方法的分析方法 用于微生物群落結構分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重復序列和隨機基因組序列等。 最常用的標記序列是核糖體操縱子

10、基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在細胞中相對穩(wěn)定，同時含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個重要指標。Diversity estimation based on molecular markers 16S rDNA是基因組的“biomarker” 核糖體RNA是蛋白質(zhì)合成必需的，16S rDNA廣泛存在于所有原核生物的基因組中。 16S rDNA的序列中包括保守區(qū)和可變區(qū)。 序列變化比較緩慢，與物種的形成速度相適應，而且一般不發(fā)生水平轉移。 GeneBank和RDP（Ribosomal DatabaseProject ）數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄了超過97,128個經(jīng)過比對和注釋的16S

11、 rDNA序列，可供進行比對。lPresent in all life molecular chronometer taxonomy (large database) evolutionlone active bacterial cell: 104 copies 15 rRNA genes (i.e., rDNA)(Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfolobus solfataricus with 1 copy, Clostridium paradoxum with 15 copies)l1500 nt (enough

12、 information)four different domains conserved regions (no variation among all life)variable regions (V1-V9)Source: Louis, B., Gene IV, 1997 1990年，Giovannoni等首先用這一方法分析馬尾藻海海面上浮游微生物的多樣性。 16S rDNA文庫中的藍藻種類與培養(yǎng)出來的藍藻很不一致； 發(fā)現(xiàn)了一個新的且在該環(huán)境中占優(yōu)勢的微生物類群； 與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法相比，更全面得揭示了微生物多樣性； 這一方法目前已經(jīng)廣泛運用于土壤、海洋、湖泊、腸道等多種生態(tài)系統(tǒng)中微

13、生物多樣性的調(diào)查，揭示了環(huán)境當中前所未知的微生物的多樣性。 用環(huán)境基因組總DNA進行16S rDNA PCR擴增：把環(huán)境中幾乎所有微生物基因組上的16S rDNA擴增并收集到一起。 universal primers: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5-TACCTTGTTACGACTT-3 (E.coli bases 1507 to 1492) “TA克隆”：把每一個16S rDNA分子放到文庫中的每一個克隆里。陽性克隆篩選的過程： 1.Amp抗性，挑選出含有質(zhì)粒的克隆 2.藍白斑篩選，挑出帶有插入片段的克

14、隆 3.PCR篩選，挑出帶有正確長度插入片段的克隆 變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世紀80 年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測DNA 片段中的點突變。 Muyzer 等人在1993 年首次將其應用于微生物群落結構研究 。后來又發(fā)展出其衍生技術，溫度梯度凝膠電泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。 此后十年間，該技術被廣泛用于微生物分子生態(tài)學研究的各個領域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一 。 雙鏈DNA

15、分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA 片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，不能被區(qū)分。 DGGE/TGGE 技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開來。 一個特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。 一個幾百個堿基對的DNA 片段一般有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解

16、鏈。 顯示的是一個234bp 長的DNA 片段的解鏈區(qū)域，橫坐標是該DNA 片段的序列，依次從第一個堿基到第234 個堿基；縱坐標是解鏈溫度。該DNA 片段共有3 個解鏈區(qū)域。 MD1 是解鏈溫度最低的一個解鏈區(qū)域，MD3 是溫度最高的一個解鏈區(qū)域。 不同的雙鏈DNA 片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。 當它們進行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。 一旦DNA 片段遷移到一定位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA 片段

17、在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，不同的DNA 片段會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。 然而，當變性劑濃度達到DNA 片段最高的解鏈區(qū)域溫度時，DNA 片段會完全解鏈，此時它們又能在膠中繼續(xù)遷移，這些片段就不能被區(qū)分開來。 在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個堿基對）可以解決這個問題。 含有GC 夾子的DNA 片段解鏈溫度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。 當加了GC 夾子后，DNA 片段中每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。 當用DGGE/TGGE 技術來研究微生物群落結構時，要結合PC

18、R（polymerase chain reaction）擴增技術，用PCR 擴增的16S rDNA 產(chǎn)物來反映微生物群落結構組成。 通常根據(jù)16S rRNA 基因中比較保守的堿基序列設計通用引物，其中一個引物的5-端含有一段GC 夾子，用來擴增微生物群落基因組總DNA，擴增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE 分析。 由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片斷，所以一般選擇擴增16S rRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。40%60%DenaturantCABCBADenaturing Gradient Gel ElectrophoresisPCR11f1512r1392r968fg

19、c16S rDNA 環(huán)境樣品的核酸提取在土壤微生物生態(tài)中非常重環(huán)境樣品的核酸提取在土壤微生物生態(tài)中非常重要。最初采用的方法主要是劇烈的機械打碎以及超聲波要。最初采用的方法主要是劇烈的機械打碎以及超聲波破碎細胞。但是這種方法得到的破碎細胞。但是這種方法得到的DNA片斷一般在片斷一般在5K10K大小大小,不適合作微生物的群落分析。微生物細胞不適合作微生物的群落分析。微生物細胞與環(huán)境中的土壤顆粒、粘土以及有機物接合緊密與環(huán)境中的土壤顆粒、粘土以及有機物接合緊密,這對這對高效率提取核酸造成了很大的困難。同時高效率提取核酸造成了很大的困難。同時,腐植酸對腐植酸對DNA的檢測和定量也有很大的影響的檢測和定

20、量也有很大的影響,主要表現(xiàn)在抑制主要表現(xiàn)在抑制DNA高溫聚合酶的活性高溫聚合酶的活性,干擾限制酶的位點識別干擾限制酶的位點識別,降低轉降低轉化效率以及化效率以及DNA雜交的特異性。雜交的特異性。Jizhong Zhou等人研等人研究了各種提取方法究了各種提取方法,他們將土壤樣品他們將土壤樣品DNA提取分為細胞提取分為細胞裂解粗提裂解粗提DNA和純化兩個步驟和純化兩個步驟,并將幾種方法進行比較并將幾種方法進行比較,建立了一種對大多數(shù)土壤樣品簡單、快速、高效的基于建立了一種對大多數(shù)土壤樣品簡單、快速、高效的基于SDS的提取方法。很多實驗表明的提取方法。很多實驗表明,現(xiàn)在能夠從土壤樣品現(xiàn)在能夠從土壤

21、樣品中提取出超過中提取出超過90%的的rDNA 基于基于PCR技術的方法也存在著不足技術的方法也存在著不足: 環(huán)境樣品在提取核酸前的厭氧或室溫存放不可避環(huán)境樣品在提取核酸前的厭氧或室溫存放不可避免的導致其樣品中微生物的變化免的導致其樣品中微生物的變化,冷凍可以減緩變化冷凍可以減緩變化,但是不能存放時間過長但是不能存放時間過長,真菌在真菌在04攝氏度仍可以觀攝氏度仍可以觀察到明顯的生長現(xiàn)象。察到明顯的生長現(xiàn)象。 每次提取每次提取DNA的效率不同的效率不同,造成結果重復性差。造成結果重復性差。 某些原核生物細胞比其他細胞容易裂解某些原核生物細胞比其他細胞容易裂解,引起裂解引起裂解程度不均一程度不均

22、一,使得不易裂解的細胞的豐度估計過低。使得不易裂解的細胞的豐度估計過低。 引物對不同樣品的擴增效率不同引物對不同樣品的擴增效率不同,引起豐度估計偏引起豐度估計偏差。差。 理論上理論上,對真核生物的分析應該象原核生物一樣進對真核生物的分析應該象原核生物一樣進行行,但是由于真核生物的核糖體的編碼基因以及調(diào)節(jié)但是由于真核生物的核糖體的編碼基因以及調(diào)節(jié)機制比較復雜機制比較復雜,對其的研究還不夠透徹對其的研究還不夠透徹,現(xiàn)今應用在真現(xiàn)今應用在真核微生物生態(tài)學的分析上還是比較少。核微生物生態(tài)學的分析上還是比較少。熒光技術熒光技術 1、綠色熒光蛋白的來源 熒光現(xiàn)象在許多海洋無脊椎動物中普遍存在著。許多刺胞亞

23、門的動物（綠色熒光）（綠色熒光）和幾乎所有櫛水母類的動物在受到刺激時都可以發(fā)出熒光。 1962年，Shimomura和Johnson等人首先從水螅水母類動物Aequorea Victoria中分離、純化出一種熒光物質(zhì)，稱為綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Proteins，GFPs)。 目前研究得較為深入的是來自多管水母科(Aequorea)和海紫羅蘭科(Renilla)的熒光蛋白，即Aequorea GFP和Renilla GFP (A-GFP和R-GFP）。2、GFP的特性： A-GFP是球狀的蛋白質(zhì)，分子量為27-30KDa的單體，最高吸收峰為395nm，肩峰為473nm

24、，發(fā)射光譜是max=508-509nm。 生色團的形成首先是Gly67的氨基對Ser65的羰基親核進攻而環(huán)化成五元環(huán)，同時失去一分子水形成咪唑基。在有氧條件下，新的N=C雙鍵促進Tyr66的、-氧化脫氫，從而形成一個連續(xù)的電子芳香族系統(tǒng)-生色團。GFP生色團形成示意圖(3和4表示不同pH條件下的兩種形式,4和5是同分異構體)成生色團。3 熒光特性 首先，僅以藍光或紫外光照射GFP就能激發(fā)其熒光，并不需要外加任何底物或共作用因子；熒光穩(wěn)定，不易衰退，只有在過熱(65)、過酸(pH4)、過堿(pH12-13)或其它變性劑(如6M胍基鹽酸)存在的條件下GFP才會變性，熒光消失。當變性條件去除后，49

25、%-90%以上的蛋白質(zhì)能夠很快復性。更重要的是，它們在很大的pH范圍內(nèi)(pH7-12.2)的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。 GFP基因的表達并沒有物種、細胞種類、位置的限制，而且GFP不論在真核細胞還是原核細胞中表達后，在藍光照射下都能產(chǎn)生強烈熒光。 4、綠色熒光蛋白的優(yōu)缺點 GFP是迄今為止唯一一種活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。（1）GFP的優(yōu)點： 檢測方便：因為GFP熒光反應不需要外加底物、酶或其它共反應因子，GFP發(fā)射的熒光用肉眼或熒光顯微鏡就可以檢測到，不會損傷正在生長的細胞和組織。 熒光穩(wěn)定：GFP對光致漂白作用有強烈的耐受性，能耐受長時間光照，從而延長了可探測時

26、間。 無毒害：GFP對生活細胞基本無毒害。 共用性和通用性：GFP的表達幾乎沒有受體范圍的限制，在原核和真核生物中都獲得了成功的表達，是一種在生物界較為“通用”的基因。其次，因為GFP較小，只含有238個氨基酸，編碼GFP的基因序列也較短，所以它可以很方便地同其它序列一起構建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉化頻率。（2）GFP的缺點：的缺點： 正因為其熒光反應不是酶反應，所以GFP的檢測不是很靈敏，而且不易對其熒光進行定量測定。 GFP基因的表達可能有假象存在：細胞本身存在一些可以受光激發(fā)的物質(zhì)，能產(chǎn)生一定量熒光。GFP標記降解菌的生態(tài)學研究 許多微生物在環(huán)境變化過程中表現(xiàn)出一種許多微生物在

27、環(huán)境變化過程中表現(xiàn)出一種“存活存活但不能被培養(yǎng)但不能被培養(yǎng)”(viable but nonculturable, VBNC)的狀態(tài)。在這種狀態(tài)下的狀態(tài)。在這種狀態(tài)下,細胞不能在傳統(tǒng)的細胞不能在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)基上生長,但仍然處于存活狀態(tài)但仍然處于存活狀態(tài),并在一定條并在一定條件下可以恢復代謝活性并轉入可培養(yǎng)的狀態(tài)。件下可以恢復代謝活性并轉入可培養(yǎng)的狀態(tài)。M. Lowder等人他們用綠色熒光蛋白等人他們用綠色熒光蛋白(GFP)的一種短的一種短半衰期突變株作為新陳代謝的指示半衰期突變株作為新陳代謝的指示,對這種狀態(tài)的對這種狀態(tài)的微生物進行了研究。這種不穩(wěn)定的蛋白不同于一微生物進行了研究。這種

28、不穩(wěn)定的蛋白不同于一般的般的GFP,在在“饑餓饑餓”或者或者VBNC狀態(tài)下很快失去狀態(tài)下很快失去熒光。這樣熒光。這樣,就可以用就可以用GFP作為指示劑監(jiān)測由于環(huán)作為指示劑監(jiān)測由于環(huán)境變化而引起微生物新陳代謝的變化境變化而引起微生物新陳代謝的變化. Boulos L.提出了一種簡便、快速計量活菌/死菌的方法,他用兩種染料對樣品染色。一種是SYTO9,分子量約為10Da的綠色染料,它可以進入活的或死的細胞中;另一種是Propidium Iodide,分子量約為668Da的紅色染料,它只進入死的細胞。菌落在紫外燈下的發(fā)光檢測(LB)A: DLLBR-45 B: DLL-1菌落在紫外燈下的發(fā)光檢測(L

29、B)A: DLL-1 B:DLLTR-45pBBRGFP-45 pTRGFP-45 DLL-1的標記與驗證 利用熒光標記的寡聚核苷酸探針標記16S rRNA或23S rRNA，然后進行原位雜交探測，可以在原位狀態(tài)下探測特定生物細胞，并可提供部分關于形態(tài)、空間分布等方面的信息。 通過FISH技術可以解決在固定群落中微生物的分布問題。原始的生物膜和絮狀污泥用多聚甲醛固定在凝膠包被的玻璃上，固定并已穿孔的細胞與熒光標記的寡核苷酸探針雜交，DNA探針就會與細胞中互補的DNA或RNA雜交；然后在熒光顯微鏡下就可以觀察到發(fā)光的細胞，偶聯(lián)的FISH在激光共聚焦顯微鏡下可以實現(xiàn)標記細胞在微生物菌落三維結構中的

30、定位。熒光原位雜交（熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization ） 常用熒光原位雜交探針一覽表探針名稱系統(tǒng)類群序列SequenceTm（C）Hyb/Wash Temp（C）salt（M NaCl）UNIVuniversalacgggcggtgtgtrcgwattaccgcggckgctg626437 (0.5)ARCHArchaeagtgctcccccgccaattcct7343 (0.5)BACTBacteria(EUB338)gctgcctcccgtaggagt6437 (0.5)EUKEucaryagggcatcacagacctgtagaaagggcaggga585437 (