1、2016.8.112016.8.11劉亭劉亭報(bào)告內(nèi)容報(bào)告內(nèi)容 基因編輯簡(jiǎn)介基因編輯簡(jiǎn)介 CRISPR/Cas9 (2013CRISPR/Cas9 (2013，第三代基因編輯技術(shù)，目前最靠譜，第三代基因編輯技術(shù)，目前最靠譜) ) NgAgo-gDNANgAgo-gDNA（20162016，第四代基因編輯技術(shù)，還不靠譜？），第四代基因編輯技術(shù)，還不靠譜？） TELENTELEN（20112011，第二代基因編輯技術(shù)），第二代基因編輯技術(shù)） ZFNZFN （20012001，第一代基因編輯技術(shù)），第一代基因編輯技術(shù)） 四代基因編輯技術(shù)的比較四代基因編輯技術(shù)的比較 基因編輯技術(shù)的其它應(yīng)用基因編輯技術(shù)的

2、其它應(yīng)用基因編輯基因編輯 概念概念 對(duì)基因組進(jìn)行人工定點(diǎn)修飾，包括敲除、敲減、插入、修正目的基因 意義意義 證明基因功能不可缺少的邏輯環(huán)節(jié) 基因工程和基因治療的重要手段 技術(shù)技術(shù) Suicide plasmid，RNAi，ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9，NgAgo-gDNA細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9TrancrRNA基因(Trans-activating crRNA)CRISPR基因 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 123N Cas基因

3、 (CRISPR-associated)Cas9 Cas1 Cas2 Csn2轉(zhuǎn)錄Pre-crRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)膿鏈球菌（SF370）DNACas 蛋白翻譯轉(zhuǎn)錄組合入侵的病毒或質(zhì)粒 DNAPAM互補(bǔ)配對(duì)剪切掃描入侵的病毒或質(zhì)粒 DNA不能復(fù)制和整合剪切互補(bǔ)配對(duì) TrancrRNA CCR5 Cas9轉(zhuǎn)化T細(xì)胞，表達(dá)基因編輯工具基因編輯工具CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9T細(xì)胞基因組DNAPAM掃描CCR5CCR5基因突變Cas9剪斷的基因基因突變基因突變非同源末端連接修復(fù)基因修正基因修正同源重組修復(fù)基因插入基因插入同源重組修復(fù)研究思路研究思路 Cas9很牛，但是也有弱點(diǎn)，如脫靶，gRN

4、A 發(fā)卡等，有沒有比它還牛的？ Argonautes有牛過Cas9 的潛力，來源廣泛，幾乎所有生物中都有，不像Cas9只存在原核生物里。某些Argonautes 可直接結(jié)合ssDNA在其引導(dǎo)下切割靶DNA，不像Cas9 需要gRNA-trancrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)才能結(jié)合gRNA發(fā)揮作用。Cas 9只能識(shí)別切割PAM域處的序列， Argonautes 沒有這個(gè)限制。 TtAgo和PfAgo可體外結(jié)合5磷酸化 ssDNA切割與它有互補(bǔ)序列的靶DNA ，但是反應(yīng)溫度是65，限制了其在細(xì)胞體內(nèi)的應(yīng)用。 有沒有其它同胞可以在37 左右其作用呢？NCBI blast找，找到一個(gè)候選的Ng-Ago。是嗜鹽堿

5、桿菌中的一個(gè)基因。 理想的Argonautes 就是要有自己的個(gè)性，與Cas 9不同，如上所述，結(jié)合DNA而不是RNA，同時(shí)能有Cas9 一樣的功能，體內(nèi)體外都能編輯基因，不斷能敲除還能敲入，并且是在37 左右。最好比cas9 更牛，不需要PAM，效率高并且不容易脫靶。Figure 1 Figure 1 NgAgo uses 5 phosphorylated ssDNA guides and cleaves DNA targets in vitro. Figure 2 Figure 2 NgAgo binds ssDNA guide in a oneguide-faithful manner.

6、Figure 3 Figure 3 NgAgo works as an endonuclease and can cleave DNA targets in vivo.Figure 4 Figure 4 NgAgo can make targeted double-strand breaks in mammalian genome. Figure 5 Figure 5 NgAgo can be used to edit mammalian genome.NgAgo-gDNANgAgo-gDNA系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì) 1.容錯(cuò)率低，錯(cuò)配一個(gè)堿基就明顯影響了NgAgo的效率，而錯(cuò)配三個(gè)就不起作用了； 2

7、.5-p-ssDNA在哺乳動(dòng)物內(nèi)稀少，這也就決定了胞內(nèi)不會(huì)有g(shù)DNA帶著NgAgo亂搞； 3.NgAgo一旦與5-p-ssDNA結(jié)合就不會(huì)再與其他的5-p-ssDNA結(jié)合； 以上三條都是講NgAgo脫靶效應(yīng)低； 4.ssDNAs易于設(shè)計(jì)和合成，因?yàn)樗灰蕾囉赑AM序列，比較容易推廣應(yīng)用。TALEN（transcription activator-like effector nuclease）轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程確定靶點(diǎn)確定靶點(diǎn)1 選擇目標(biāo)基因外顯子中相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點(diǎn)TALENTALEN基因敲除基本流程基因

8、敲除基本流程載體構(gòu)建載體構(gòu)建2.1 TAL靶點(diǎn)識(shí)別域的克隆構(gòu)建TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程載體構(gòu)建載體構(gòu)建2.2 2.2 將將TALTAL靶點(diǎn)識(shí)別域克隆入特定的真核表達(dá)載體靶點(diǎn)識(shí)別域克隆入特定的真核表達(dá)載體TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程轉(zhuǎn)化敲除基因轉(zhuǎn)化敲除基因3 將重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞以表達(dá)重組核酸酶，敲除基因TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程篩選突變體篩選突變體4. 4. 篩選突變體篩選突變體鋅指核酸酶（鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFNZinc-finger nuclease, ZFN）技

9、術(shù)）技術(shù)第一到第四代基因編輯技術(shù)的比較第一到第四代基因編輯技術(shù)的比較NgAgo-gDNANgAgo-gDNAgDNA脫氧核糖核苷酸Ago蛋白多位點(diǎn)編輯20bp雙鏈斷裂；單鏈缺刻非常容易？較輕？CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用不只是基因編輯不只是基因編輯 轉(zhuǎn)錄調(diào)控，表觀修飾等 TrancrRNA GOI dCas9TALETALE技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用不只是敲除不只是敲除 靶向基因敲除，敲入，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，表觀修飾靶向基因敲除，敲入，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，表觀修飾CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9研究歷史研究歷史p1987年，日本科學(xué)家在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)

10、串聯(lián)間隔重復(fù)序列。p隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，2002年，正式將其命名為CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。p2005年西班牙科學(xué)家發(fā)現(xiàn)CRISPR 的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)（如噬菌體基因組序列）高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。p2007年，Barrangou 等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini 等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能。p2012-2014年：Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier解釋了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理。理論上指向了一種全新的基因組編輯技術(shù)。p2013年初，麻省理工學(xué)院博德研究所的張