1、高效液相色譜法改動(dòng) 20.1 概述20.2 高效液相色譜法的分類與基本原理 20.2.1 高效液相色譜法的分類 20.2.2 基本原理20.3 各類高效液相色譜法 20.3.1 液固吸附色譜法 20.3.2 液液分配色譜法 20.3.3 化學(xué)鍵合相色譜法 20.3.4 其他色譜法20.4 固定相 20.4.1 液固色譜固定相 20.4.2 化學(xué)鍵合相 20.4.3 其他固定相20.5 流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)） 20.5.1 分離方程式 20.5.2 Snyder溶劑分類 20.5.3 正相洗脫與反相洗脫 20.5.4 洗脫方式 20.5.5 流動(dòng)相最優(yōu)化方法簡(jiǎn)介20.6 高效液相色譜儀 20.6.1

2、 輸液泵 20.6.2 色譜柱與進(jìn)樣器 20.6.3 檢測(cè)器 20.6.4 超高效液相色譜儀20.7 定性、定量分析方法 20.7.1 定性分析方法 20.7.2 定量分析方法高效液相色譜法概述 高效液相色譜法 HPLC （high performance liquid chromatograph） 高壓輸液泵 高效固定相 高靈敏度檢測(cè)器高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較 見(jiàn)表高效液相色譜法與GC的比較 見(jiàn)表 高效液相色譜法的 分類與基本原理20.2.1 高效液相色譜法的分類按固定相的聚集狀態(tài)： LLC和LSC按分離機(jī)制： 分配、吸附、離子交換（IEC）、空間排阻（SEC）、親合（AC）、手

3、性（CC）、膠束（MC）、電色譜法（EC）。HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狹）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（親和）MC（膠束）CC（手性）20.2.2 高效液相色譜法的基本原理HPLC的范氏方程：討論： 渦流擴(kuò)散項(xiàng)：填料和填充均勻程度高效液相色譜柱的裝填縱向擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻力項(xiàng)溫度一般為室溫 選甲醇、乙腈粘度小的溶劑粒徑綜上所述，HPLC應(yīng)采用：1)采用小粒徑、窄粒度分布的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相，用均漿法裝柱；2）采用低粘度流動(dòng)相，低流速（1ml/min)；3）柱溫一般以2535度為宜。太低，則流動(dòng)相的

4、粘度增加，溫度高易產(chǎn)生氣泡。流速分析型HPLC一般流量為1mL/min。各類高效液相色譜法20.3.1 液固吸附色譜法分離機(jī)理 溶質(zhì)分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附吸附劑表面吸附活性中心，靠溶質(zhì)分子的分配系數(shù)（容量因子）不同而分離。影響容量因子的因素 溶質(zhì)分子的極性 溶劑的極性 硅膠的活性若以硅膠為固定相： 洗脫劑：以烷烴為底劑，加適量極性調(diào)整劑組成的二元或三元流動(dòng)相。流動(dòng)相應(yīng)該不含水。20.3.2 液液分配色譜法分離機(jī)理 靠樣品組分溶入固定相與流動(dòng)相達(dá)到“平衡”后分配系數(shù)的差別而分離。正、反相液液色譜法 注意流出順序。 目前，物理涂漬的液液色譜幾乎已被化學(xué)鍵合相所取代。20.3.3 化學(xué)鍵合相色譜法

5、 將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，就構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法（bonded phase chromatograph，BPC）化學(xué)鍵合相的優(yōu)點(diǎn) 均一、穩(wěn)定；不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好。反相鍵合相色譜法（RBPC或RHPLC） 固定相：在載體表面鍵合含弱極性或中等極性的基團(tuán)，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（CH3）、苯基等。流動(dòng)相：以水做主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。 出峰順序： 極性強(qiáng)的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。分析對(duì)象： 分離非極性至中等極性的各種分子型化合物。

6、影響保留時(shí)間的因素： 溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)： 極性越弱，保留時(shí)間越長(zhǎng)。 流動(dòng)相的表面張力、介電常數(shù)和pH值： 對(duì)于二元或多元體系改變?nèi)軇┑呐浔瓤筛淖兞鲃?dòng)相的表面張力和介電常數(shù)。通常，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑含量增加，k變小。例如：在水甲醇體系中增加甲醇的量，可降低表面力和介電常數(shù)，使容量因子變小。正相鍵合相色譜法 固定相：在載體表面鍵合含中等極性或較強(qiáng)極性的基團(tuán)，如氰基（CN）、氨基（NH3）、或二羥基等。 流動(dòng)相：以非極性或弱極性的溶劑如己烷、庚烷等為主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。出峰順序： 極性弱的組分先出柱，極性強(qiáng)的組分后出柱。影響保留時(shí)間的因素： 鍵合相的種類、流動(dòng)相的

7、強(qiáng)度、試樣的性質(zhì)。 流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，保留時(shí)間縮短。適應(yīng)范圍： 分離溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。反相離子對(duì)色譜法（RPIC）寫(xiě)成通式：表：反相離子對(duì)色譜的離子對(duì)試劑序號(hào)反離子種類主要應(yīng)用對(duì)象1季銨鹽（如四丁基銨磷酸鹽TBA、溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）強(qiáng)酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氫化可的松及其鹽2叔銨（如三辛銨）磺酸鹽、羧酸等3烷基磺酸鹽（如甲基、戊基、己基、庚基、樟腦磺酸鹽）強(qiáng)堿、弱堿、兒茶酚胺、鴉片堿等4高氯酸胺5烷基磺酸鹽（如十二烷基磺酸鹽、正庚烷基磺酸鈉（PICB7)與3類似，選擇性不同離子對(duì)色譜法的適用對(duì)象： 用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換

8、色譜法無(wú)法分離的離子型和非離子型化合物的混合物的分離。離子抑制色譜法 （ion suppression chromatograph，ISC） 在反相色譜法中，通過(guò)向流動(dòng)相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及乙酸鹽）來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制樣品組分的離解，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。調(diào)節(jié)pH范圍：27.5 pH8.0 破壞鍵合相與載體的結(jié)合 pH8）不穩(wěn)定；在孔隙中大分子擴(kuò)散困難，降低柱效；硅膠表面上的剩余硅羥基對(duì)分離有影響。 目前研制的基質(zhì)有：氧化鋁、氧化鋯、氧化釷和氧化鈦。主要掌握正相和反相鍵合相： 鍵合的

9、基團(tuán)的極性及適用情況。 表：反相HPLC常用的化學(xué)鍵合相類型牌號(hào)名稱官能團(tuán)粒度/m形狀說(shuō)明長(zhǎng)鏈YWG-C18H37C18硅烷10非球形Partisil ODSC18硅烷5，10非球形5CZprbax ODSC18硅烷6球形15C短鏈LiChrosorb RP-8C8硅烷5，10非球形1314CYWG C6H6苯基硅烷10非球形7CLiChrosorb RP-2二甲基硅烷5，10非球形5C鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn) 含碳量： 指鍵合在硅膠表面上的烷基所含碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，隨鏈長(zhǎng)增長(zhǎng)，從322。 覆蓋度： 指硅膠被鍵合后，在硅膠中的有效羥基與硅烷試劑反應(yīng)的程度，在鍵合后有時(shí)還用短鏈的硅烷試劑與剩余和新產(chǎn)生的羥

10、基反應(yīng)，使羥基全部被”帽蓋“（即封尾）而不起作用。 鍵合相的特點(diǎn)： 使用過(guò)程中不流失； 化學(xué)穩(wěn)定性好； 適于梯度洗脫； 載樣量大。流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)）HPLC對(duì)流動(dòng)相的要求： 不與固定相反應(yīng)；對(duì)試樣有適宜的溶解度，k在110之內(nèi)，最好在25之間；與檢測(cè)器相適應(yīng)；純度高，粘度小。 使用前濾過(guò)，脫氣。20.5.1 分離方程式 討論：主要受溶劑種類的影響；在溶劑組成確定后，k主要由溶劑的配比所左右。20.5.2 Snyder溶劑分類 Snyder選擇了3個(gè)參考物質(zhì)，用于檢驗(yàn)溶劑的3種分子間作用力，分別用Xe、 Xd、 Xn表述。 表：參考物與被檢溶劑間的作用力參考物乙醇（質(zhì)子給予體）二氧六環(huán)（質(zhì)子受體

11、）硝基甲烷（強(qiáng)偶極）被檢溶劑的作用力類型質(zhì)子受體作用力(Xe)質(zhì)子給予體作用力(Xd)強(qiáng)偶極作用力(Xn) 描述溶劑極性用Snyder提出的溶劑極性參數(shù)P來(lái)衡量。表：常用溶劑的極性參數(shù)和選擇性參數(shù)溶劑PXeXdXn正戊烷0.0-乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.31 可將81種色譜溶劑，按Xe、 Xd、 Xn在三角形坐標(biāo)圖上的相鄰關(guān)系分為8類。 選擇不同組別的溶劑，分子作用力不同，容易使改變，利于分離。20.5.3 正相洗脫與反相洗脫 溶劑洗脫強(qiáng)度指流動(dòng)相中溶劑的洗脫能力, 它不僅與流動(dòng)相，而

12、且與固定相的極性有關(guān)。在正相色譜中, “溶劑洗脫強(qiáng)度”與溶劑極性成正比；而在反相色譜中，溶劑極性越大, 洗脫能力越小。 反相鍵合相色譜法的溶劑強(qiáng)度用另一強(qiáng)度因子S表示。表：反相色譜常用溶劑的強(qiáng)度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇異丙醇四氫呋喃03.03.23.43.53.64.24.5混合液設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)技術(shù)： 根據(jù)溶劑選擇性分組，選具有顯著選擇性差異的溶劑。 反相：水為底劑，甲醇、乙腈和四氫呋喃為選擇性溶劑。 正相：已烷或戊烷為底劑，乙醚、氯仿和二氯甲烷為選擇性溶劑。混合溶劑的強(qiáng)度20.5.4 洗脫方式等度洗脫： 在一個(gè)分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少、性質(zhì)差別不大的試樣。梯度洗脫（程

13、序洗脫） 在一個(gè)分析周期內(nèi)程序程序控制改變流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，可使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異很大的組分，能在各自適宜的分離條件（容量因子k適宜）下分離。梯度洗脫能縮短分析時(shí)間、提高分離度、改善峰形、提高檢測(cè)靈敏度。高效液相色譜儀總 圖高壓泵 主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性梯度淋洗裝置 外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。 內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀

14、態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：高效分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。液相色譜檢測(cè)器 紫外檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)： 靈敏度高；線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。（參照書(shū)P539：截止波長(zhǎng)）熒光檢測(cè)器（FD） 靈敏度比紫外檢測(cè)器高，選擇性好，但只能適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)（或通過(guò)衍生化能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)）的檢測(cè)。電化學(xué)檢測(cè)器： 包括極譜、庫(kù)侖、安培和電導(dǎo)檢測(cè)器。 安培檢測(cè)器可檢測(cè)具有氧化還原活性（能發(fā)生電極反應(yīng)）的物質(zhì)，靈敏度高。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）： 是通用型的檢測(cè)器。它適合于檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相