1、電離輻射的生物效應(yīng).概述電離輻射將能量傳送給有機(jī)體引起的任何改動(dòng)，統(tǒng)稱為電離輻射生物學(xué)效應(yīng)ionizing radiation biological effect，人類的放射損傷是一種嚴(yán)重的病理性輻射生物效應(yīng) 。.電離輻射對機(jī)體的作用首先是輻射能量向細(xì)胞分子的傳送，包括水分子和生物大分子。進(jìn)而影響細(xì)胞、組織、器官乃至整個(gè)機(jī)體。生物大分子主要涉及DNA、RNA和蛋白質(zhì)，其中DNA的輻射效應(yīng)尤為重要。.一、小白鼠受-射線后LD50/15的測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、察看不同劑量射線全身照射小白鼠后，在15天內(nèi)死亡的百分率，測定小白鼠的LD50/15 。 2、掌握由外照射復(fù)制實(shí)驗(yàn)性急性放射病的普通方法及其照射

2、動(dòng)物的條件和程序。.實(shí)驗(yàn)原理 照射劑量與生物效應(yīng)之間存在一定的相依關(guān)系。總的規(guī)律是劑量愈大，效應(yīng)愈顯著，但并不全呈直線關(guān)系。 電離輻射對多細(xì)胞機(jī)體特別是高等動(dòng)物引起的死亡率變化的劑量效應(yīng)關(guān)系呈一條S型曲線，曲線闡明，當(dāng)死亡率在50附近時(shí)，曲線有急劇的變化，即在此處劑量較小的變化就引起較明顯死亡率改動(dòng)。因此將引起被照機(jī)體死亡50時(shí)的劑量稱為半致死劑量(LD50)，作為衡量機(jī)體放射敏感性的參數(shù)， LD50數(shù)值愈小，機(jī)體的放射敏感性愈高 . 普通以不同劑量的射線照射同種系、同性別、同年齡的小白鼠，使之產(chǎn)生急性放射損傷，以15天內(nèi)小鼠的死亡率作為生物效應(yīng)目的，得到劑量死亡率曲線。.動(dòng)物 安康雄性BAL

3、B/c小鼠，體重20克。.照射方法與步驟 1、取120只雄性小白鼠，隨機(jī)分成10組，每組分別放入二個(gè)動(dòng)物籠內(nèi)豢養(yǎng)。2、計(jì)算：距放射源等間隔時(shí)，不同的照射劑量，所需的時(shí)間或照射時(shí)間一樣時(shí)，動(dòng)物距放射源的間隔。 .3、在每組動(dòng)物籠壁上標(biāo)明照射劑量，60Co射線的照射劑量分別為1.24、1.56、1.96、2.46、3.08、3.86、4.84、6.06、7.60、9.52Gy。各組在照射時(shí)間一半時(shí)，調(diào)理動(dòng)物籠保證全身均勻照射。照后，常規(guī)豢養(yǎng)。4、照射后按規(guī)定時(shí)間記錄。每天上午、下午、晚上各察看一次，記錄小白鼠的死亡數(shù)，共察看15天。.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、小白鼠LD50/15計(jì)算統(tǒng)計(jì)表.組別照射劑量（Gy）

4、相鄰兩組劑量比值對數(shù)劑量動(dòng)物數(shù)死亡數(shù)死亡率（%）概率單位11.241.2540.09310021.561.25410110（0.1）3.7231.961.25410110（0.1）3.7242.461.25410220（0.2）4.1653.081.25410220（0.2）63.861.25410574.841.25410686.061.25410797.601.254109109.521.2541010.2、利用目測概率單位法和寇氏法求出小白鼠LD50/15，并繪制出小白鼠死亡率曲線。.目測概率單位法(1) 根據(jù)各組小白鼠死亡率，從百分率與概率單位對照表中查到各組死亡率的概率單位(死亡率0

5、和100者不列入計(jì)算)。(2) 取方格坐標(biāo)紙，橫坐標(biāo)表示劑量對數(shù)，縱坐標(biāo)表示概率單位。(3) 沿著各點(diǎn)的分布趨勢，用直尺繪制出一條適宜各點(diǎn)的直線，力求直線經(jīng)過各點(diǎn)中間。(4) 從概率單位5.0(死亡率50)經(jīng)過所畫直線處找出相對應(yīng)的對數(shù)劑量。5再對對數(shù)劑量取反對數(shù)即得出實(shí)踐LD50/15的照射量 .實(shí)習(xí)報(bào)告 根據(jù)小白鼠LD50/15計(jì)算統(tǒng)計(jì)表的數(shù)據(jù)，用目測法和寇氏法計(jì)算出小白鼠LD50，并繪制小白鼠死亡率曲線，以及求出小白鼠LD50的可信限。.分析討論思索題1、運(yùn)用放射源照射動(dòng)物應(yīng)留意哪些事項(xiàng)？2、怎樣用隨機(jī)方法對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組?3、什么叫半數(shù)致死量LD50，測定LD50有何意義?.二、電離輻射

6、引起DNA鏈斷裂的測定實(shí)驗(yàn)原理 鏈斷裂是電離輻射所致DNA損傷中常見的和重要的方式。電離輻射作用后引起DNA鏈斷裂，產(chǎn)生片段化DNA。 . 許多熒光燃料可用來標(biāo)志DNA，這些染料有：Hoechst、DAPI(46-diamidino-2-phenylindole，46-二脒基2-苯基吲哚)、溴化乙啶、吖啶橙等。 DAPI是DNA特異熒光染料，DAPI結(jié)合雙鏈DNA的小溝，尤其是A-T堿基簇部分，為非嵌入方式，結(jié)合后，熒光加強(qiáng)約20倍。DAPI與DNA結(jié)合后以紫外激發(fā)，發(fā)射出亮堂的藍(lán)色熒光，用熒光分光光度儀測定出熒光強(qiáng)度。.關(guān)鍵技術(shù)1、 裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶

7、解。 2、已裂解的細(xì)胞液最好用硅化過的吸管汲取。硅化后玻璃不利于生物體如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸的貼附。3、 各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。DNA的提取.4、 取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾5、提取DNA過程中所用到的試劑和器材要經(jīng)過高壓烤干等方法進(jìn)展無核酸酶化處置。 6、一切試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。.試劑和主要儀器一、試劑：1、細(xì)胞裂解液1 10mmolL Tris，pH 7.4 lmmolL EDTA，pH7.5 0.5 TritonX-1002、細(xì)胞裂解液II(用時(shí)新穎配制) 細(xì)胞裂解液中參與蛋白酶K 0.1mgml(終濃度).3、熒光緩沖液 10mmolL Tr

8、is，pH7.4 10mmolL EDTA，pH7.5 100mmolL NaCl4、DAPI儲存液 1mg/L DAPI注*：DAPI能夠是致癌劑。吸入、吞食或經(jīng)皮膚吸收均有害。配制試劑時(shí)應(yīng)戴手套，勿吸入粉塵。.5、0.01mol/L PBS6、白細(xì)胞稀釋液 ：2%冰醋酸二、主要儀器 熒光分光光度儀 .實(shí)驗(yàn)步驟 1、動(dòng)物分組與照射： 雄性安康昆明小鼠20只，體重20g左右。隨機(jī)分為假照射對照組，1.0Gy，2.0Gy和4.0Gy射線全身照射組。.2、制備胸腺細(xì)胞單細(xì)胞懸液 照射后12h，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取仰臥位，剪開胸前皮膚和肌肉，用鑷子分別并迅速取出胸腺，剔除周圍結(jié)締組織留意察看比

9、較照射組小鼠與假照組小鼠胸腺的差別，放入平皿中，用小試管或毛玻片悄然研磨。制備單細(xì)胞懸液，調(diào)理細(xì)胞濃度為1107細(xì)胞/ml。.3、DNA的提取與分別5106個(gè)細(xì)胞 0.01mol/L PBS洗二次1500rpm、5min加細(xì)胞裂解液I 100ul 4C，30min冰箱 1600rpm離心，20min 5106個(gè)細(xì)胞 0.01mol/L PBS洗二次1500rpm、5min加細(xì)胞裂解液I 100ul 4C，30min冰箱 1600rpm離心，20min. 上清 片段化DNA 沉淀加細(xì)胞裂解I 100ul1600rpm離心，20min混合 200ul上清片段化DNA完好DNA 上清上清片段DNA

10、沉淀完好DNA加細(xì)胞裂解液II 200ul片段化DNA.4、DNA熒光檢測 取3ml熒光緩沖液，加DAPI0.1mg/ml60ul，參與DNA樣品上清或沉淀10ul，用熒光分光光度計(jì)儀測定熒光強(qiáng)度。激光波長355nm，發(fā)射波長455nm。.5、DNA裂解率的計(jì)算.分析討論思索題 1、電離輻射所致DNA鏈斷裂的方式及其分子機(jī)制？2、除熒光分光光度儀，還可用什么儀器檢測DNA，設(shè)計(jì)一詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，測定不同劑量照射時(shí)DNA的斷裂率。3、DNA損傷的生物學(xué)意義？.三、小鼠骨髓造血干細(xì)胞劑量存活曲線的測定 細(xì)胞劑量存活曲線描畫輻射劑量與細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。對于有完好增殖才干的細(xì)胞，如骨髓造血干細(xì)胞

11、或離體培育生長的細(xì)胞等，凡保管其增殖才干能繼續(xù)繁衍產(chǎn)生克隆或集落，稱之為存活細(xì)胞。在體內(nèi)或離體培育條件下，一個(gè)存活細(xì)胞繁衍成的一個(gè)細(xì)胞群體，稱之為一個(gè)細(xì)胞集落(Colony)。這些細(xì)胞一旦喪失完好的增殖才干，即發(fā)生增殖死亡。實(shí)驗(yàn)原理. 經(jīng)過體內(nèi)或體外丈量技術(shù)可測定不同劑量照射后細(xì)胞的集落數(shù)，計(jì)算出各劑量點(diǎn)細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(Surviving fraction)，并繪制出該細(xì)胞的劑量存活曲線，求出相應(yīng)的參數(shù)(如D37值或D0值等)，以比較細(xì)胞的放射敏感性。 . 本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞存活的體內(nèi)丈量技術(shù)，測定骨髓多能造血干細(xì)胞的劑量存活曲線。其原理是：將受不同劑量照射小鼠(稱之為供體)的骨髓細(xì)胞移植到受致死

12、劑量照射的同系小鼠(稱之為受體)體內(nèi)。供體造血干細(xì)胞可在受體脾臟增殖構(gòu)成集落，稱之為脾集落或脾結(jié)節(jié)。因此時(shí)受致死劑量照射的受體小鼠體內(nèi)已無內(nèi)源性造血干細(xì)胞存在，故移植后在受體小鼠脾臟構(gòu)成的脾結(jié)節(jié)那么全部來自供體。. 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)可測定出不同劑量照射后的脾結(jié)節(jié)數(shù)，計(jì)算出存活分?jǐn)?shù)，并繪制出骨髓多能造血干細(xì)胞的劑量存活曲線。.主要試劑和器材 1640培育液 白細(xì)胞稀釋液 75酒精 Bouins液(苦昧酸-甲醛固定液) 超凈任務(wù)臺 光學(xué)顯微鏡 .實(shí)驗(yàn)步驟1、骨髓細(xì)胞懸液制備(供體) 1殺鼠取股骨無菌操作： 受不同劑量照射的供體小鼠，于照后24h頸椎脫臼處死，無菌條件下取出一側(cè)股骨，用無菌紗布除掉附著的肌肉

13、。.2 制備骨髓單細(xì)胞懸液 剪去股骨上端，用裝有6號針頭的注射器事先用1640培育液沖洗由骰骨下端刺入，將骨髓腔內(nèi)的全部骨髓細(xì)胞沖入盛有10ml培育液的廣口瓶中(反復(fù)沖3次)。然后，換4號針頭吹打細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為5105個(gè)ml。置廣口瓶于冰上，保管細(xì)胞備用。 .2、受體小鼠的預(yù)備及骨髓細(xì)胞輸注1) 受體照射： 受體小鼠接受8.5Gy射線全身照射，照后24h進(jìn)展骨髓細(xì)胞輸注。2) 骨髓細(xì)胞輸注： 將備用供體骨髓細(xì)胞懸液充分混勻后，吸入裝有4號針頭的lml注射器中，經(jīng)尾靜脈輸注入受體中。每只鼠輸入0.2ml懸液，含骨髓細(xì)胞105個(gè)。.3、脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù) 骨髓細(xì)胞輸注后9天，殺鼠取脾臟，置入Bouins液中固定12h后，解剖顯微鏡下或用放大鏡計(jì)數(shù)脾結(jié)節(jié)數(shù)。.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄于附表中。 2、繪制劑量存活曲線。 .組別供體受體存活分?jǐn)?shù)照