1、實 驗 總RNA的提取、定量與RT-PCR南方醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA 方面的研究工作如Nothern雜交、mRNA別離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。掌握從細(xì)胞中提取總RNA的方法熟悉紫外吸收法檢測RNA濃度與純度的原理及測定方法掌握RT-PCR基因擴增的原理和操作方法目 的 :/實 驗 流 程提取原理操作步驟逆轉(zhuǎn)錄原理操作步驟提 取總RNA定 量合成cDNA第一鏈原理體系引物選擇PCR電泳原理電泳步驟電 泳計算方法操作步驟第一局部 細(xì)胞總RNA的提取及定量原 理10-5mg RNA/細(xì)胞 mRNA 3端存在20

2、-250個多聚腺苷酸(polyA) 結(jié)構(gòu)，可用oligo(dT)親和層析柱別離mRNA。RNA別離的方法：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，鹽酸胍-有機溶劑法，氯化鋰-尿素法，蛋白酶K-細(xì)胞質(zhì)RNA提取法等、異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。rRNA 80-85%：28S 18S 5StRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%原 理：Trizol的主要成分Trizol 是一種新型總 RNA 抽提試劑主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，其主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白/核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白

3、質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還參加了8-羥基喹啉、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。在參加氯仿離心后，溶液分為水相和有機相，RNA在上層水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質(zhì)。原 理所有的提取過程中都有五個關(guān)鍵點：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源酶的有效抑制；有效地將從和蛋白混合物中別離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。 關(guān) 鍵 點RNA酶污染來源RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人

4、員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染。 最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶：而各種組織和細(xì)胞中那么含有大量內(nèi)源性的RNA酶。防止RNA酶污染的措施 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6h或更長時間。 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇枯燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。 配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC在37處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的

5、無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過濾除菌。 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。 設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。 操作步驟 1.勻漿化作用 懸浮細(xì)胞連同培養(yǎng)液8000離心2min,棄上清；參加ml的isoPlus,用移液槍反復(fù)吹吸直無明顯沉淀,室溫靜置5min.2. 別離階段 向勻漿樣品中參加氯仿，劇烈震蕩15s，室溫下孵育5min，12000g離心15min，吸取上清至新Ep管。3. RNA的沉淀 向上清中參加等體積異丙醇，上下顛倒混勻,室溫孵育10min， 12000g離心10min，小心吸取并棄去上清液，可見膠狀沉淀。4. RNA的漂洗 加1mL 75乙醇洗

6、滌沉淀一次，輕輕上下顛倒洗滌， 12000g離心5min,棄去乙醇.5. RNA的再溶解 空氣枯燥RNA沉淀，注意不要完全枯燥，參加10uLRNase-Free處理水，充分震蕩混勻。原 理：物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng) 而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜 因此不同波長的單色光通過溶液時其光的能量就會被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.紫外光吸收法紫外吸收檢測RNA的濃度RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約 40g/ml 的單鏈RNA。用雙蒸水稀釋RNA樣

7、品n倍并以雙蒸水為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260 值即可計算出樣品稀釋前的濃度: RNA (mg/ml) = 40OD260 讀數(shù)稀釋倍數(shù)(n)/1000RNA純品的OD260 /OD280 的比值為，故根據(jù)OD260 /OD280 的比值可以估計RNA的純度。假設(shè)OD260/OD280小于2，說明可能有DNA片段污染，可以考慮用無RNase的DNase處理樣品，假設(shè)小于，說明樣品中還可能含有蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化RNA。假設(shè)比值太高大于，那么提示RNA有降解。紫外吸收檢測RNA的純度RNA完整性檢測完整的RNA的甲醛電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶，并且28

8、S大約是18S的兩倍寬。假設(shè)兩條帶不明顯, 那么說明RNA局部降解,可能的原因是污染了RNase。 常見問題分析RNA得率低： A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。沉淀未完全溶解。A260/A2801.65 ： 應(yīng)使用TE Buffer稀釋后再進(jìn)行吸光度值的測定。 低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。 B.樣品勻漿時加的試劑量太少。 C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘。 D.吸取水相時混入了有機相。沉淀未完全溶解。RNA降解 A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。 B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70，而保存在了-5至-20。 C.細(xì)胞在用胰酶處理時過度。 D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去

9、除處理。 E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5 。DNA污染 A.樣品勻漿時加的試劑量太少 B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇，DMSO等)，強緩沖液或堿性溶液常見問題分析第二局部逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反響 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用OligodT或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因

10、的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。原 理鼠白血病病毒MMLV反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37。在長時間的逆轉(zhuǎn)錄過程中，不會造成模板的降解，獲得cDNA的幾率大，適用于較長的cDNA鏈的合成。 禽成髓細(xì)胞瘤病毒AMV反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42。Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和Su

11、perScript。此種酶較其它酶能多將更大局部的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。一反轉(zhuǎn)錄酶的選擇 隨機六聚體引物：用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性

12、方面均要小。特異性引物：是用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。 二引物的選擇 三內(nèi)參的設(shè)定為了保證實驗結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴增目的基因時，參加一對內(nèi)參照基因的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA，作為對照。常用的內(nèi)參有GAPDH 3-磷酸甘油醛脫氫酶、-Actin-肌動蛋白等。其目的在于防止RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反響體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。儀器和主要試劑基因擴增儀、微量加樣槍、滅菌超薄PCR反響管總RNA第一鏈cDNA合成試劑盒 含有逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、緩沖液dNTP mix：含

13、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/LTaq DNA聚合酶操作步驟采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 合成cDNA第一鏈按以下組分配制RT反響液5X PrimeScrip Buffer 2uLPrimeScriptOligo dTRandom 6mers (100uM) uL反轉(zhuǎn)錄反響條件如下37 60min 反轉(zhuǎn)錄反響85 5sec 反轉(zhuǎn)錄酶失活反響注：反轉(zhuǎn)錄步驟在PCR儀中進(jìn)行取0.2 ml PCR反響管一只，用微量加樣槍按下述順序分別參加各試劑(注意每換一種試劑換一個新吸頭)： 如配好的反響液較多沾到管壁上，可將PCR反響管置臺式離心

14、機中瞬時離心，使反響液集中于管底，然后將反響管放到基因擴增儀(PCR儀)上 .PCR反響體系PerfectShot Taq 10uLcDNA 第一鏈產(chǎn)物 GAPDH Forward Primer (10uM) 1uLGAPDH Reverse Primer (10uM) 1uLH2O PCR反響條件如下94 5min;94 30sec;60 30sec；72 1min-30循環(huán)72 7min 本實驗所擴增的產(chǎn)物DNA片段長度400bp500bp, 可取5lPCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。利用標(biāo)準(zhǔn)DNA-marker評估擴增的特異性。 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形

15、成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動.DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系).瓊脂糖凝膠電泳原理影響遷移速率因素 1、 DNA的分子大小 2、 瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構(gòu)象 4、 電源電壓 5、 嵌入染料的存在 6、 離子強度影響 瓊脂糖凝膠電泳原理有效別離范圍實驗材料電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 染料：Gelview、EB電泳緩沖液：TBE瓊脂糖DNA Marker 5000溴化乙錠(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，可與DNA結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,有致癌性.Gelview: 是一種新型核酸染料,可與DNA分子形成復(fù)合物，能產(chǎn)生極強的熒光信號，其靈敏度比EB高, 且熒光強度與DNA含量成正比熒光,在紫外光照射下呈現(xiàn)綠色熒光.常用染料實驗材料含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時，加樣用做比照來檢測瓊脂糖凝膠是否有問題。應(yīng)選擇在目標(biāo)