1、淺談木犀草素對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用9200字 木犀草素，多以糖苷的形式存在于多種植物中，這些植物以全葉青蘭、辣椒、野菊花、金銀花、紫蘇含量較高。具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用。據(jù)最新研究，呼吸道病癥咳嗽、咳痰、喘息，均與氣道慢性炎癥有關(guān)。如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、變應(yīng)性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被認(rèn)為與部分的炎癥浸潤有關(guān)，炎癥的存在，使得氣道的免疫應(yīng)答混亂，患者常出現(xiàn)氣道反響性增高。摘要 討論木犀草素(luteolin，Lut)對對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。CCK8法檢測Lut對L02細(xì)胞活性的影響;挑選

2、APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的濃度及作用時(shí)間;細(xì)胞形態(tài)學(xué)、CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測分析Lut對APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡的影響;比色法檢測細(xì)胞上清液中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性;RTPCR檢測凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl2，caspase3的表達(dá)。結(jié)果顯示Lut在2.540 mu;mol#12539;L-1不影響L02細(xì)胞活性;12 mmol#12539;L-1 APAP作用于L02細(xì)胞12 h可用于建立肝細(xì)胞損傷模型。與模型組相比，Lut組細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，胞體增大，貼壁才能恢復(fù)明顯;細(xì)胞凋亡率明顯下降;MDA含量顯著下降(P關(guān)鍵詞 木犀草素;

3、L02細(xì)胞; 氧化應(yīng)激; 細(xì)胞凋亡; 對乙酰氨基酚對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種常見的解熱鎮(zhèn)痛藥，APAP在治療劑量下平安，但過量使用會(huì)造成急性肝損傷1。APAP過量服用在許多國家已成為成心或意外死亡的原因之一23。目前，有證據(jù)證實(shí)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是APAP引起急性肝損傷的重要生物學(xué)機(jī)制之一47，因此，討論可以有效預(yù)防或緩解APAP引起的急性肝損傷途徑具有積極的臨床意義。木犀草素(luteolin，Lut)屬于黃酮類化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金銀花、紫蘇葉等植物中，近年研究說明木犀草素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用811。本文通過預(yù)防性給藥，研究給

4、藥后氧化應(yīng)激損傷相關(guān)生理指標(biāo)變化，討論Lut的細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡作用，為對乙酰氨基酚肝損傷的防治提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)根據(jù)。一、材料1.1 細(xì)胞 正常人肝細(xì)胞株(L02)為本實(shí)驗(yàn)室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ，5% CO2且飽和濕度條件下進(jìn)展常規(guī)培養(yǎng)。1.2 藥品與試劑 DMEM(高糖)培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素均購自GIBCO公司;Cell Counting Kit8 (CCK8)購自東仁化學(xué)科技(上海);木犀草素(luteolin，Lut)、五味子乙素(schizandrin B，Sch B)均購自成都普菲德生物技術(shù);APAP購自中國食

5、品藥品檢定研究院;AnnexinVFITC/PI試劑盒購自Sigma公司;谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;逆轉(zhuǎn)錄和PCR反響試劑盒購自Thermo Fisher Scienfitic公司;Bax，Bcl2，caspase3引物均購自Invitrogen公司。1.3 儀器 酶標(biāo)儀( BioTek Synergy H1 H1MFD，美國);DMIL HC型倒置相差顯微鏡(Leica，德國);流式細(xì)胞儀(BD FACS Canto )。二、方法2.1 細(xì)胞培養(yǎng) L02細(xì)胞培養(yǎng)按照常規(guī)培養(yǎng)的方法，含10%胎牛血清、100 kU#12

6、539;L-1青霉素和100 g#12539;L-1鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，37 ，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.2 CCK8檢測Lut對L02細(xì)胞活性的影響 將L02細(xì)胞以7x104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 mu;L，接種12 h細(xì)胞全部貼壁后，分別給予0，2.5，5，10，20，40，80，160 mu;mol#12539;L-1的Lut，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照孔和空白對照孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37 ，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后CCK8檢測L02細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。細(xì)胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)x100%，式中Ac為對照孔吸光度，As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度，

7、Ab為空白孔吸光度。2.3 APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞肝損傷模型的建立 將濃度為7x104個(gè)/mL的L02細(xì)胞接種到96孔板，每孔100 mu;L，接種12 h細(xì)胞全部貼壁后，設(shè)0，6，12，18，24，30 mmol#12539;L-1濃度梯度的APAP進(jìn)展造模，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照孔和空白對照孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別在造模3，6，12，24，48 h后棄上清液，用CCK8檢測L02細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。2.4 Lut對APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的影響 實(shí)驗(yàn)分6組，分別是對照組、模型組(APAP，12 mmol#12539;L-1)、3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(Lut，濃度分別為2.5，5，10 mu;mo

8、l#12539;L-1)和陽性對照組(五味子乙素12，Sch B，5 mu;mol#12539;L-1)。取對數(shù)生長期L02細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為7x104個(gè)/mL，接種于96孔板中，37 ，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組更換為相應(yīng)的含藥培養(yǎng)液，對照組和模型組更換新的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，除對照組外，其余各組參加APAP 12 mmol#12539;L-1造模，造模12 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后棄上清液，用CCK8檢測L02細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。2.5 AnnexinV FITC/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡 將L02細(xì)胞按照1x105個(gè)/mL 接種到6孔板

9、中，每孔2 mL，分組、給藥及造模同2.4項(xiàng)，造模12 h后，將L02細(xì)胞消化下來，按照Annexin VFITC/PI說明書方法對細(xì)胞進(jìn)展染色，利用流式細(xì)胞儀檢測L02細(xì)胞凋亡情況。2.6 培養(yǎng)液MDA，GSH及SOD程度的檢測 將L02細(xì)胞按照1x105個(gè)/mL 接種到6孔板中，分組、給藥及造模同2.4項(xiàng)，造模12 h后搜集細(xì)胞培養(yǎng)上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)展操作，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA含量、GSH及SOD活性。2.7 RTPCR檢測Bcl2，Bax和caspase3 mRNA表達(dá) 分組、加藥及造模同2.2項(xiàng)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。造模12 h后搜集細(xì)胞，應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA

10、，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以beta;actin為內(nèi)參進(jìn)展擴(kuò)增，檢測細(xì)胞中Bcl2，Bax和caspase3 mRNA的表達(dá)量。Bcl2，Bax和caspase3 引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)展。2.8 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0應(yīng)用軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用plusmn;s表示，多組間比擬采用單因素方差分析，以P三、結(jié)果3.1 CCK8檢測Lut對L02細(xì)胞活性的影響 為了尋找適宜的Lut反響濃度，本實(shí)驗(yàn)考察了Lut(2.5，5，10，20，40，80，160 mu;mol#12539;L-1) 對L02細(xì)胞活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)Lut濃度在2.5，5，10 m

11、u;mol#12539;L-1時(shí)活性最強(qiáng)，故本實(shí)驗(yàn)采用2.5，5，10 mu;mol#12539;L-1的濃度梯度進(jìn)展后續(xù)試驗(yàn)，見圖1。3.2 APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷模型的建立 本研究首先考察APAP濃度和刺激時(shí)間對L02細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果顯示隨著APAP濃度的增加，L02細(xì)胞的存活率逐漸降低;隨著造模時(shí)間的延長，一樣APAP濃度下的L02細(xì)胞的存活率逐漸降低。綜合考慮造模時(shí)間和造模濃度，以IC50為原那么，實(shí)驗(yàn)中12 mmol#12539;L-1APAP造模12 h的抑制率為(49.64plusmn;3.30)%，因此，本研究選擇造模時(shí)間為12 h和造模濃度為12 mmol#12539

12、;L-1的APAP進(jìn)展后續(xù)試驗(yàn)，見圖2。3.3 Lut對APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的影響 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞生長良好、背景明晰，細(xì)胞貼壁結(jié)實(shí)，單個(gè)細(xì)胞呈扁平的梭形，透明度大、遮光性均勻;模型組(APAP，12 mmol#12539;L-1)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，胞體縮小呈圓形。與模型組相比，Lut組和陽性藥五味子乙素(Sch B)中的細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，貼壁才能恢復(fù)明顯，胞體增大，多數(shù)細(xì)胞呈梭形。從L02細(xì)胞形態(tài)變化上可見，Lut 在一定程度上可顯著減輕APAP的損傷作用，進(jìn)步細(xì)胞存活率，說明Lut對APAP損傷的L02細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，見圖3。CCK8檢測結(jié)果顯示，模

13、型組中細(xì)胞存活率顯著降低(P3.4 Lut 對L02細(xì)胞凋亡的影響 凋亡流式檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組(APAP，12 mmol#12539;L-1)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P3.5 木犀草素對APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞中MDA，GSH及SOD的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，APAP組MDA含量明顯升高，而GSH和SOD活性明顯降低(P3.6 Lut對凋亡相關(guān)基因Bcl2，Bax和caspase3表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，APAP組Bax和caspase3 mRNA表達(dá)明顯升高(P四、討論近年研究說明Lut具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用。本研究通過建立APAP

14、誘導(dǎo)的肝損傷模型，討論Lut對APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。APAP 誘導(dǎo)建立的肝損傷模型是目前較為常用的肝損傷模型，此模型造模時(shí)間短、易復(fù)制、穩(wěn)定性好，是挑選保肝藥物的理想模型1315。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APAP(12 mmol#12539;L-1)能明顯抑制L02細(xì)胞活性，Lut干預(yù)后，與模型組比擬，L02細(xì)胞活性明顯改善，其中10 mu;mol#12539;L-1 Lut的藥效最為明顯。氧化應(yīng)激在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中起著重要作用16。MDA是脂質(zhì)過氧化反響的產(chǎn)物，其上下常常可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD是平衡機(jī)體氧化與抗氧化的關(guān)鍵酶，能去除超

15、氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活性也是判斷細(xì)胞損傷程度的相關(guān)指標(biāo)。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，去除體內(nèi)的超氧離子及其他自由基，防止肝細(xì)胞損傷。GSH 是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，其程度的多少是衡量機(jī)體抗氧化才能大小的重要因素。因此本實(shí)驗(yàn)測定三者程度來反映細(xì)胞氧化應(yīng)激程度。本研究顯示，與模型組相比，Lut組氧化指標(biāo)MDA含量明顯降低，抗氧化指標(biāo)GSH和SOD活性那么顯著進(jìn)步(P氧化應(yīng)激損傷可以引起細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，胞體縮小呈圓形;而Lut組細(xì)胞狀態(tài)較模型組明顯改善，貼壁才能恢復(fù)明顯，胞體增大。CCK

16、8檢測結(jié)果顯示，模型組中細(xì)胞存活率顯著降低(P細(xì)胞凋亡是一種由多種基因參與調(diào)控的程序性死亡的過程，現(xiàn)多種基因與細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，包括Bcl2家族基因(Bcl2，Bclxl，Bax，Bad等)，p53，F(xiàn)as，F(xiàn)asL等都參與了凋亡的調(diào)控17。Bcl2家族基因能抑制或激活凋亡，其中Bax和Bad等基因可促進(jìn)凋亡，而Bcl2和Bclxl等基因能抑制細(xì)胞凋亡18，Bax那么通過抑制Bcl2的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡19。caspase3屬于半胱氨酸蛋白酶家族一員，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase3表達(dá)的增加、激活是外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑凋亡信號(hào)通路共同的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此是凋亡發(fā)

17、生的標(biāo)志酶20。RTPCR結(jié)果顯示，木犀草素是通過下調(diào)Bax和caspase3 mRNA及促進(jìn)Bcl2 mRNA的表達(dá)而抑制APAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜上所述，木犀草素通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)其對APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)GSH和SOD活性，同時(shí)下調(diào)Bax和caspase3 mRNA及上調(diào)Bcl2 mRNA的表達(dá)有關(guān)，但詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步討論。參考文獻(xiàn)1 Jaeschke H， Williams C D， Ramachandran A， et al. Acetaminophen hepatotoxicity and repair： the r

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