1、 第四章 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture) 動(dòng)物體內(nèi)取出組織和細(xì)胞，在體外模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件，建立無(wú)菌、適溫和一定的營(yíng)養(yǎng)條件，使之生長(zhǎng)和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)，稱動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)。 是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)根底：細(xì)胞融合、組織工程、胚胎工程、干細(xì)胞工程、動(dòng)物克隆、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的大規(guī)模制備技術(shù)等等都離不開(kāi)。4.1 概 述4. 1.1 開(kāi)展歷史4.1.2 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)4.1.3 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的概念4.1.4 動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)生長(zhǎng)特性4. 1.1 開(kāi)展歷史1、動(dòng)物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)的起源： 19世紀(jì)所應(yīng)用的胚胎學(xué)技術(shù)。 動(dòng)物細(xì)胞

2、培養(yǎng)的奠基人：美國(guó)生物學(xué)家哈里森1907年用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活幾周，有細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過(guò)程。 先驅(qū)者中法國(guó)學(xué)者卡勒爾：設(shè)計(jì)卡氏培養(yǎng)瓶自1923年用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織成功以后，已使多種動(dòng)物組織培養(yǎng)獲得成功。 4. 1.1 開(kāi)展歷史2、20世紀(jì)40年代以后： 動(dòng)物組織培養(yǎng)的科學(xué)家們研究重點(diǎn)集中在培養(yǎng)基方面。3、20世紀(jì)80年代以后： 隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)的迅速發(fā)展，已能把特定的外源基因通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增幾千倍，并可轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，使其得到高質(zhì)量的表達(dá)。 4. 1.1 開(kāi)展歷史4、近年：淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入了一個(gè)新領(lǐng)域。雜交瘤細(xì)胞

3、能在體外懸浮情況下大量繁殖并產(chǎn)生單克隆抗體。 隨著基因重組和單克隆抗體技術(shù)的開(kāi)展，動(dòng)物細(xì)胞組織培養(yǎng)展現(xiàn)出越來(lái)越可觀的工業(yè)化前景。4.1.2 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)一動(dòng)物細(xì)胞之間的連接特點(diǎn)： 1.緊密連接：牢固、無(wú)間隙。 2.間隙連接： 2-3nm間隙。 3.隔壁連接： 20-30nm間隔，有橫隔。 4.中間連接： 無(wú)橫隔、透明，間隔20-30nm。 5.橋粒連接： 有間隙，有纖維形成的特殊結(jié)構(gòu)。4.1.2 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)二動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)： 1.動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁。 2.動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受污染。 3.培養(yǎng)過(guò)程需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感。 4.動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體

4、形式存在。 5.原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化死亡。4.1.3 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的概念動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境條件，在無(wú)菌、適宜溫度和豐富營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)根底。 貼附和非貼附生長(zhǎng)： 1.貼附型細(xì)胞：細(xì)胞間相互接觸；細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)器皿壁或載體結(jié)合。多數(shù)細(xì)胞屬貼附型細(xì)胞。 2.非貼附型細(xì)胞：此類細(xì)胞體外生長(zhǎng)不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。如：白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。貼附型細(xì)胞(anchorage-dependent cell) 哺乳動(dòng)物大多數(shù)細(xì)胞

5、必須附著固體外表生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞布滿表面單層時(shí)，即停止生長(zhǎng)。假設(shè)取走一片細(xì)胞 ，存留的細(xì)胞就會(huì)沿著外表生長(zhǎng)而重新布滿外表。從生長(zhǎng)外表脫落而進(jìn)入液體的細(xì)胞通常不再生長(zhǎng)而逐漸退化。為單層附壁培養(yǎng) 按培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，可分四類： 1.成纖維型細(xì)胞(fibroblast) 外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞相似，梭形或不規(guī)那么形。 細(xì)胞貼壁后呈梭形，胞質(zhì)外伸出2-3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，成放射狀，胞間疏松。 起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為這種形式。貼附型細(xì)胞2. 上皮型細(xì)胞(epithelium)： 泛指形狀上類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞。特點(diǎn)：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)那么。胞間緊密，單層貼壁。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)如此

6、。3. 游走型細(xì)胞(wandering)： 類似巨噬細(xì)胞樣的特征。外形不規(guī)那么。 分散生長(zhǎng)，不連接成片，成群落；通常伸出偽足和突起，貼壁位置不固定，呈活潑的游走和變形運(yùn)動(dòng)。 單核巨噬細(xì)胞系細(xì)胞體外培養(yǎng)常如此：顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。貼附型細(xì)胞4. 多形型細(xì)胞( polymorphic)： 形態(tài)上不規(guī)那么難以確定其形態(tài)的細(xì)胞。 細(xì)胞胞體略呈多角形；細(xì)胞胞突細(xì)長(zhǎng)形；類似絲狀偽足。 如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞影響細(xì)胞形態(tài)的主要因素細(xì)胞的來(lái)源不同；生理?xiàng)l件不同，功能狀態(tài)不同；血清成分、培養(yǎng)基成分、 添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣象環(huán)境、溫度等不同。 如HeLa細(xì)胞原本是一種上皮

7、型癌細(xì)胞，但假設(shè)在過(guò)酸或過(guò)堿的條件下培養(yǎng)，可以呈現(xiàn)梭形，當(dāng)酸堿適中時(shí)又可以恢復(fù)上皮型特征。非貼附型細(xì)胞或懸浮型細(xì)胞suspend cell 此類細(xì)胞體外生長(zhǎng)不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。如：白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。 形態(tài)：始終為球狀 優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞密度高，培養(yǎng)效率高，易操作控制，便于大規(guī)模生長(zhǎng)。 有些細(xì)胞既可懸浮，也可以貼附。4.1.5 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性1、 貼附： 細(xì)胞接種后很快形成偽足，與底物點(diǎn)接觸，細(xì)胞逐漸呈放射狀伸展，細(xì)胞體中心變扁平狀。 影響因素：低鈣不利于細(xì)胞伸展；低溫和培養(yǎng)液流動(dòng)過(guò)快阻礙貼附；生物因素：表皮生長(zhǎng)因子刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的皺褶活動(dòng)、成

8、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子減少3T3細(xì)胞的扁平度。4.1.5 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性2、接觸抑制contact inhibition： 正常細(xì)胞移動(dòng)、靠近而接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)且停止接觸區(qū)質(zhì)膜的皺褶活動(dòng)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞的重疊生長(zhǎng)。腫瘤癌細(xì)胞無(wú)此現(xiàn)象。3、密度抑制density inhibition： 只要營(yíng)養(yǎng)充分，接觸抑制的細(xì)胞仍能分裂增殖。但細(xì)胞密度進(jìn)一步加大、營(yíng)養(yǎng)減少、代謝產(chǎn)物增多時(shí)，因營(yíng)養(yǎng)和代謝物的影響細(xì)胞分裂停止，出現(xiàn)接觸抑制。4.1.6 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過(guò)程 、細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程： 培養(yǎng)的細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)的時(shí)間有限，最終自行停止生長(zhǎng)。細(xì)胞的種類、性狀、原供體的年齡決定其生存時(shí)間長(zhǎng)短。 如：

9、人胚成纖維細(xì)胞存活一年、傳3050代相當(dāng)于150300個(gè)細(xì)胞周期；供體是成體或衰老個(gè)體時(shí)那么存活更短；肝、腎細(xì)胞僅能傳幾代或十幾代。 獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化遺傳性改變生存期那么發(fā)生變化。4.1.6.1 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程： 1、原代培養(yǎng)期primary culture phage)：從取出體內(nèi)組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的時(shí)期。14周。 細(xì)胞：移動(dòng)活潑、分裂但不旺盛、相似于也能代表體內(nèi)組織、藥物測(cè)試的好對(duì)象。 2、傳代期passage phase：原代細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間后，將其分開(kāi)接種到多個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程稱傳代。 細(xì)胞系cell line：傳代細(xì)胞分裂增殖旺盛、能保持一致的二倍體核型，稱細(xì)胞系。細(xì)

10、胞的代數(shù)=轉(zhuǎn)接的次數(shù)。每一代中細(xì)胞分裂36次。4.1.6.1 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程：3、衰亡期senescence phase：細(xì)胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。 細(xì)胞可發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，其標(biāo)志之一：獲永久增殖能力而成連續(xù)細(xì)胞系株。連續(xù)細(xì)胞系株：主要發(fā)生在傳代期。 細(xì)胞系cell line：第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞。 細(xì)胞株cell strain：在經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系中，通過(guò)單細(xì)胞培養(yǎng)或篩選法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。 亞株substrain：？ 體 外 培 養(yǎng) 細(xì) 胞 系 的 生 長(zhǎng) 曲 線0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 t周接種培養(yǎng)第一次傳代衰老死亡 傳 代 期

11、細(xì) 胞 系連續(xù)細(xì)胞系原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)化傳代間隔細(xì) 胞 濃 度 的 指 數(shù) 4.1.6.2 每代群體細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程 每代細(xì)胞要經(jīng)過(guò)四個(gè)生長(zhǎng)階段：1、潛伏期latent phase： 接種懸浮貼附不馬上分裂潛伏。原初代培養(yǎng)細(xì)胞：2496 h；傳代和腫瘤細(xì)胞：624 h。2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期logarthmic growth phase： 分裂旺盛、分裂相增多其數(shù)量標(biāo)志分裂的旺盛程度。 細(xì)胞分裂指數(shù)mitotic index, MI: MI=(分裂相個(gè)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞) 100% 。初代MI低，傳代和腫瘤細(xì)胞系MI高達(dá)35% 。4.1.6.2 每代群體細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程 在理想的環(huán)境下，細(xì)胞處于較恒定的生長(zhǎng)分裂狀況

12、，其生長(zhǎng)速率： dN dt N N時(shí)間 t 時(shí)的細(xì)胞個(gè)數(shù)； 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率：在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，群體細(xì)胞數(shù)增殖一倍所需要的時(shí)間，以時(shí)間T表示 積分得： T 2 (時(shí)間T表示細(xì)胞比生長(zhǎng)速率) 此時(shí)期細(xì)胞以指數(shù)形式增長(zhǎng)繁殖。持續(xù)35天。 4.1.6.2 每代群體細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程 3、穩(wěn)定期stationary phase：因培養(yǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，特別是代謝廢物的累積，細(xì)胞進(jìn)入：新分裂的細(xì)胞數(shù)與死亡的細(xì)胞數(shù)相等的動(dòng)態(tài)平衡時(shí)期。 細(xì)胞數(shù)不增加，但代謝還是活潑的。 4、衰亡期senescence：營(yíng)養(yǎng)物的耗盡和有害物質(zhì)的作用，細(xì)胞死亡數(shù)大于細(xì)胞分裂數(shù)。 最高分裂次數(shù)限制：正常細(xì)胞都有，腫瘤癌細(xì)胞沒(méi)有。 細(xì)胞濃

13、度的對(duì)數(shù)潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期衰亡期 0 24 48 72 96 120 h每代群體細(xì)胞生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期4.2 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的根本技術(shù)4.2.1 體外培養(yǎng)的特點(diǎn)4.2.2 培養(yǎng)條件和工具4.2.3 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)技術(shù)4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù)4.2.5 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法4.2.6 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)4.2.8 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)狀與展望4.2.1 體外培養(yǎng)的特點(diǎn) 1、動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求苛刻：氨基酸細(xì)胞是不能自主合成必須氨基酸的、單糖能源；合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料、維生素輔酶、輔基、其他大量和微量元素、促生長(zhǎng)因子和激素促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、維持

14、細(xì)胞功能、保持細(xì)胞分化和未分化狀態(tài) 2、培養(yǎng)環(huán)境條件要求嚴(yán)格：溫度、滲透壓多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞260320mOsmkg、pH及溶氧量CO2和HO-的相對(duì)恒定、剪切力等。 3、易污染、防污染：細(xì)菌、真菌、病毒；血清和組織材料。4.2.2 培養(yǎng)條件和工具一、培養(yǎng)條件：1. 溫度：2. pH：3. 氣體：4. 營(yíng)養(yǎng)：二、培養(yǎng)工具：1. 器皿：2. 載體：4.2.2 培養(yǎng)條件和工具一、培養(yǎng)條件： 1、溫度：多數(shù)哺乳動(dòng)物37，偏離那么影響代謝和生長(zhǎng)。高溫對(duì)細(xì)胞的威脅更大。 2、pH：最適，低于6、高于影響生長(zhǎng)甚至死亡。 3、氣體：容器空間中O2和CO2細(xì)胞代謝的進(jìn)行。O2 ？ CO2 ？ CO2培養(yǎng)箱？ 4

15、、營(yíng)養(yǎng)：需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生長(zhǎng)因子。4.2.2 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基 1. 天然培養(yǎng)基natural medium：來(lái)自動(dòng)物體液或組織別離提取的培養(yǎng)基。 種類：生物性液體如血清、組織浸液如胚胎浸液、凝固劑如血漿等。 1血清：主要為牛胎牛、新生牛、小牛、馬、雞、兔、羊、人血清。各有特點(diǎn)。含各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長(zhǎng)因子及無(wú)機(jī)物等，在生理平衡下促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。成分復(fù)雜，不同 種類、不同廠家、不同批號(hào)作用有有差異。4.2.2 培養(yǎng)條件天然培養(yǎng)基 血清提供細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和增殖必須的激素與生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素雌二醇、孕酮、睪酮、

16、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF、表皮生長(zhǎng)因子EGF、血小板生長(zhǎng)因子PDGF 2 鼠尾膠原及其他膠原：細(xì)胞附著、生長(zhǎng)的基質(zhì)，利于組織特別是上皮類細(xì)胞的固定。 3雞胚浸出液：含生長(zhǎng)因子、核蛋白、氨基酸等，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。 4水解乳蛋白：氨基酸含量高。用于原代和細(xì)胞系的培養(yǎng)。4.2.2 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基 2、合成培養(yǎng)基synthetic medium：給細(xì)胞提供近似體內(nèi)的生理環(huán)境，且便于控制和標(biāo)準(zhǔn)化。但不是完全培養(yǎng)基，只能維持細(xì)胞不死而不能促進(jìn)細(xì)胞分裂。使用時(shí)需加天然培養(yǎng)基。 1根本培養(yǎng)基essential medium：人工合成的只能使體外培養(yǎng)細(xì)胞短暫生存添加天然培養(yǎng)基后細(xì)胞才能繁殖的培養(yǎng)基。也稱通用培養(yǎng)基

17、可用于許多細(xì)胞。低限量根底培養(yǎng)基主要含：無(wú)機(jī)鹽、微量元素、氨基酸、維生素、碳水化合物等?，F(xiàn)已有幾十種，用途不同。4.2.2 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基2、合成培養(yǎng)基： 2無(wú)血清培養(yǎng)基serun free medium,SFM：化學(xué)限定性培養(yǎng)基或化學(xué)成清楚確培養(yǎng)基chemicaldefined medium)。不需添加血清就可維持體外細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。在根底理論研究中血清的使用影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果原因與結(jié)果難以對(duì)應(yīng)。包括兩局部： 根底培養(yǎng)液：合成培養(yǎng)液，如HamF12和DMEM以及許多已商品化的根底培養(yǎng)液，SEM用于角質(zhì)細(xì)胞,SFM 用于淋巴細(xì)胞，等等。 4.2.2 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基的添加

18、成分： 1細(xì)胞外基質(zhì)extracellular matrix,ECM：促進(jìn)貼壁。如纖連蛋白FN，層粘連蛋白LN等。 FN促進(jìn)中胚層源細(xì)胞的貼壁和分化； LN作用于內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)胚層源細(xì)胞。 2促生長(zhǎng)因子與激素： 3酶抑制劑：如大豆胰酶抑制劑。胰酶消化傳代 4結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：如轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清蛋白，增加黏度，免受機(jī)械損傷。4.2.3 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù)4.2.3.1 原代培養(yǎng) 1、組織塊培養(yǎng) 處死動(dòng)物，無(wú)菌取組織塊入小燒杯中，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎片，補(bǔ)加3-5mLHanks液，用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。 2、組織消化培養(yǎng) 1

19、取材、別離、消化 消化軟組織：0.25%胰蛋白酶 消化纖維組織：膠原酶 消化傳代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液：EDTA+胰蛋白酶.1 原代培養(yǎng) 2、培養(yǎng)： 接種：接種量大小視情況而定；防污染；常規(guī)檢查：1-2天做一次。 4.2.3.2 傳代培養(yǎng)： 原代細(xì)胞分裂增殖成片，布滿器皿外表時(shí)，那么需對(duì)其別離進(jìn)行重新培養(yǎng)。 傳代技術(shù)的關(guān)鍵： 1、傳代時(shí)機(jī)：80-90%集合時(shí)最好過(guò)早：細(xì)胞產(chǎn)量缺乏 過(guò)晚：細(xì)胞健康不佳。 2.酶消化的方法和細(xì)胞對(duì)酶的反響：敏感/遲鈍酶作用時(shí)間和方法，細(xì)胞的類型和來(lái)源4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù) 4.2.4.1 貼壁培養(yǎng)的材料： 貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞貼附在一定的固相外表進(jìn)行培養(yǎng)。 1玻璃：明礬硅硼

20、膠玻璃。 2塑料：聚苯乙烯。 3金屬：不銹鋼和肽。 4微載體：天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物 4.2.4.2 貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性 1、游離期：接種的細(xì)胞，懸浮，細(xì)質(zhì)回縮變圓。 2、吸附期：細(xì)胞類型不同，貼壁時(shí)間有差異。貼壁快：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞，傳代細(xì)胞；貼壁慢：組織快，較大細(xì)胞團(tuán)；不利于細(xì)胞貼壁的：細(xì)胞狀態(tài)不好，培養(yǎng)基pH不正常，培養(yǎng)瓶不潔。 3、繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞，此時(shí)有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，無(wú)細(xì)胞分裂。經(jīng)一段停滯，開(kāi)始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，開(kāi)始接觸并連接成片，這時(shí)期細(xì)胞分裂及運(yùn)動(dòng)停止。 4、退化期：細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁達(dá)一定密度，隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細(xì)胞開(kāi)始退化。4.2.5

21、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法懸滴培養(yǎng)法旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法灌注小室培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法4.2.5.1 懸滴培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法：將組織器官植塊接種于一蓋玻片上，加一滴培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)蓋玻片植塊和培養(yǎng)液懸掛放置于凹形哉玻片上，熔蠟密封入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。是最早的傳統(tǒng)技術(shù)1907年Harrison創(chuàng)立。懸滴培養(yǎng)法示意圖4.2.5.2 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法：19331934年Gey 和 Lewis建立管狀培養(yǎng)器皿固定于旋轉(zhuǎn)裝置上旋轉(zhuǎn)， 培養(yǎng)物接種于器皿 中培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境利于細(xì)胞組織生長(zhǎng)。 缺點(diǎn)：旋轉(zhuǎn)管不易在顯微鏡下觀察。可將培養(yǎng)物接種在載玻片上，再入旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，取載玻片觀察。

22、4.2.5.3 灌注小室培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法：最初由Burrows1912年設(shè)計(jì)。載玻片上下 壁，金屬圈側(cè)壁，密封成小室，其側(cè)面有液體流入和流出口。 特點(diǎn)：液體可循環(huán)供給。 后來(lái)的許多大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)在設(shè)計(jì)上都參考了此方法的原理。4.2.5.4 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：培養(yǎng)物直接接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。最早采用的是Carrel1923年設(shè)計(jì)的卡氏瓶。 與此相關(guān)的方法：載玻片加培養(yǎng)瓶法。優(yōu)點(diǎn)：防止培養(yǎng)瓶外表粗糙對(duì)培養(yǎng)物的影響；方便染色觀察和永久保存；增加了培養(yǎng)面積。4.2.5.5 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法：將培養(yǎng)物接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。曾叫微量培養(yǎng)法，是最常

23、用的體外培養(yǎng)技術(shù)方法。 常用的一次性的培養(yǎng)板：6孔、24孔、96孔96孔最常用。 4.2.6 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)根底根底上，融合固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反響器和人工灌流等技術(shù)而開(kāi)展起了動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。包括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維法、微多孔載體培養(yǎng)等。 4.2.6.1 懸浮培養(yǎng)技術(shù) 少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于懸浮生長(zhǎng)型，離體培養(yǎng)時(shí)不需附著物，只需懸浮于培養(yǎng)液中就可以良好生長(zhǎng)。 動(dòng)物活體組織分散、過(guò)濾、離心、純化、漂洗，接種到適宜培養(yǎng)液中，于特定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。酶消化形成分散細(xì)胞加培養(yǎng)液終止消化吹打分散形成分散細(xì)胞剪切成細(xì)快酶消化、吹打分散形成細(xì)

24、胞懸浮液逐級(jí)稀釋細(xì)胞懸浮液制備過(guò)程示意圖4.2.6.2 微載體培養(yǎng)技術(shù) 最初在培養(yǎng)液中加小滾瓶增加貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)面積，此法構(gòu)造簡(jiǎn)單，本錢低，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行。但：勞動(dòng)強(qiáng)度大、滾瓶空間大而提供的面積有限、細(xì)胞產(chǎn)率低、監(jiān)控不便。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞技術(shù)(Van Wezel,1967):一定程度上改變了其缺乏、最初的載體為離子交換樹(shù)脂微珠60250微米。后經(jīng)改進(jìn)，選帶不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子帶適當(dāng)電荷作微載體，利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。4.2.6.2 微載體培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞支持物微載體基質(zhì)應(yīng)具備的特征：1. 生物相容性；2. 簡(jiǎn)便的無(wú)毒害固定化3. 良好的傳質(zhì)特性；4.良好的機(jī)械穩(wěn)定性；5.

25、最大的比外表積、6.適合細(xì)胞生長(zhǎng)的形狀和?。?. 粒徑分布均一；8. 能高壓滅菌；9. 可重復(fù)利用，易于清洗；10. 保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷；11.接種方便；12.能固定大局部細(xì)胞；13.適合大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)；14.細(xì)胞載體培養(yǎng)基易別離；15.適于貼壁和懸浮培養(yǎng)；4.2.6.3 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 將細(xì)胞包裹在微囊中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。微囊是一種人造半透膜制成的微球體，小分子 物質(zhì)可自由穿過(guò)，酶、輔酶、離子交換劑、活性碳、蛋白質(zhì)包裹在其中不能逸出，催化反響底物。 20世紀(jì)80年代初Lim和Sum制成了細(xì)胞能在其中生長(zhǎng)的微囊。微囊材料：海藻酸1,4-鍵連接的多聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸、多聚賴氨酸。4.2.6.

26、4 中空纖維法 中空纖維法：1972年Richard Kncazek創(chuàng)造。最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜，外表有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞生存的立體三維空間類似于毛細(xì)血管。 36層空心纖維構(gòu)成培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞接種于空心纖維的外腔。別離純化細(xì)胞分泌物極其方便。 現(xiàn)在已開(kāi)發(fā)出硅膠、聚砜、聚丙烯等的空心纖維。4.2.6.5 微多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 傳統(tǒng)實(shí)心微載體的缺乏：只能固定貼壁細(xì)胞、后期細(xì)胞老化而脫落、貼壁需血清中的因子幫助。 微多孔載體培養(yǎng)：克服了其缺乏。載體內(nèi)部有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔供細(xì)胞生長(zhǎng)、增加細(xì)胞的固定化和穩(wěn)定化，可用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：降低血清用量、易固定化、

27、比外表積大、細(xì)胞免受機(jī)械損傷、適合于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)、也適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。 4.2.6.5 微多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 微多孔載體的制作材料：生物相容性無(wú)毒、黏 附細(xì)胞、機(jī)械穩(wěn)定性保證長(zhǎng)期攪拌不破粹和清洗 處理回收利用、熱穩(wěn)定性高溫高壓滅菌不分解、 不破粹、不軟化要好。 制備：1. 成球材料和臨時(shí)性成孔材料分散于介質(zhì) 中液滴，2. 液滴固化成小球，3. 去除如高溫?zé)Y(jié) 臨時(shí)性成孔材料，形成多孔微球，4.后期處理表 面處理、清洗、滅菌等。多孔微載體的制備成球材料分散介質(zhì)成 球成孔去除球中的成孔物質(zhì) 后期處理多孔微載體 4.2.6.5 微多孔載體的制備方法 材料不同、制備方法不同。1

28、. 高溫?zé)Y(jié)法：玻璃、陶瓷等。 高嶺土、云母成孔材料、礬土、氫氧化鋁、二氧化硅 碾細(xì)混勻，加甲基醋酸纖維素 漿液 擠壓球狀顆?？菰?000燒結(jié)幾小時(shí)陶瓷小顆粒1400 熔化云母多孔陶瓷載體。 4.2.6.5 微多孔載體的制備方法 2. 高分子材料成球聚和法： 水懸浮分散介質(zhì)加分散劑，強(qiáng)力攪拌不溶于水的單體分散成小液珠加引發(fā)劑油溶性 成珠狀小球100105 去除未反響的單體和成孔物質(zhì)稀酸清洗夾在微球中的分散劑多孔微球氧化劑處理使其外表極化親水的多孔載體。 2.4.6.5 微多孔載體的制備方法 3.聚合物快速凝聚法：海藻酸鈉溶液在氯化鈣溶液中快速凝聚成球。 4.銳孔噴液冷凍凝固法：成球材料溶于水溶

29、液銳孔噴射成小液滴低溫疏水性物質(zhì)中遇冷凝固含冰晶的固體小球物理化學(xué)方法固化成球材料去除小球中的冰晶，成多孔性小球。 4.2.6.5 微多孔載體的制備方法 5. 油浴復(fù)相乳液別離法：油溶性成孔材料K劇烈攪拌乳化分散到成球材料 P 的水溶液中水包油型小液滴在分散到油性物質(zhì)O中復(fù)相油滴溶劑N與水混溶但不溶解P吸出液滴中的水分硬化成固體小球加熱、減壓、溶劑萃取、冰凍枯燥等去除成孔材料多孔微球。4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)一、生物反響器： 傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反響器不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大量培養(yǎng)。因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁、非常脆弱、對(duì)剪切敏感、對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格。 20世紀(jì)70年代以來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)用反響

30、器種類越來(lái)越多，規(guī)模越來(lái)越大。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣升式、固定床為主。 國(guó)外，氣升式反響器已放大到5 00010 000L，攪拌式反響器到達(dá)8 000L。4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)二、應(yīng)用： 1962年以后，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大，如今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛采用的技術(shù)方法。 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)具有獨(dú)特的作用和意義，也是植物、微生物細(xì)胞培養(yǎng)所無(wú)法替代的。動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境與植物微生物細(xì)胞全然不同。動(dòng)物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工較大或更復(fù)雜的蛋白質(zhì)特別是加工蛋白質(zhì)的環(huán)境、過(guò)程、結(jié)果等是植物微生物細(xì)胞極少有的；能將目的蛋白分泌到培養(yǎng)液中，從而簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)

31、的別離、純化。4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 二、應(yīng)用：目前動(dòng)物細(xì)胞生物反響器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物制品主要類型： 1、病毒疫苗：如乙肝疫苗HbsAg、脊髓灰質(zhì)炎疫苗Polio、狂犬疫苗Rabies等； 2、非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：如干擾素IFN、白細(xì)胞介素IL、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子BCGF、巨噬細(xì)胞激活因子MAN、T細(xì)胞替代因子(TRF)等。 3、多肽生長(zhǎng)因子：神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF、表皮生長(zhǎng)因子EGF、血清生長(zhǎng)因子SF等。4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用 4、酶類：組織血纖維溶酶原激活計(jì)t-PA等； 5、激素：紅細(xì)胞生產(chǎn)素EPO、促黃體生成素LH、促濾泡素FSH;

32、 6、腫瘤特異性抗原：癌胚抗原CEA等； 7、單克隆抗體MCAB； 8、病毒殺蟲(chóng)劑：桿狀病毒等。 4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)三、關(guān)鍵技術(shù)一細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 1.氨離子 2.乳酸 3.二氧化碳 4.甲基乙二醛 5.滲透壓 6.載體二細(xì)胞死亡與凋亡三培養(yǎng)基與細(xì)胞系四過(guò)程監(jiān)控4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)三、關(guān)鍵技術(shù)： 一細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境： 1、氨離子：提高細(xì)胞密度的主要限制因子是培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積累。氨的積聚來(lái)源于培養(yǎng)基和細(xì)胞的代謝使細(xì)胞內(nèi)UDP氨基己糖增加，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)糖基化過(guò)程。應(yīng)防止培養(yǎng)基中Gln自然分解和盡量去除培養(yǎng)基中的氨。 2、乳酸：糖代謝產(chǎn)物。高濃度乳酸

33、抑制乳酸脫氫酶LDH活性減少乳酸產(chǎn)生阻止NAD的再生和丙酮酸乳酸轉(zhuǎn)換NADH 增加抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、Gln消耗減少產(chǎn)能減少抑制生長(zhǎng)。因此應(yīng)減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度以減少乳酸同時(shí)平衡葡萄糖與Gln的比例。關(guān)鍵技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境： 3、二氧化碳：CO2 累積改變 細(xì)胞代謝水平、對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。應(yīng)通過(guò)控制供氣參數(shù)，平衡氧的輸送及CO2的去除，防止生物反響器運(yùn)轉(zhuǎn)中CO2的積累。 4、甲基乙二醛MG)：為丙糖磷酸去磷酸基主要、脂類、氨基酸代謝產(chǎn)物。對(duì)細(xì)胞有潛在損傷。MG能改變氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。葡萄糖濃度很高時(shí)，MG升高。加小牛血清可降低MG的濃度。關(guān)鍵技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境： 5、滲透壓

34、：高滲透壓提高細(xì)胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)短、細(xì)胞死亡速度。滲透壓保護(hù)劑：甘氨酸、甜菜堿和三甲基甘氨酸或脯氨酸可一定程度保護(hù)高滲對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并不影響目的蛋白的表達(dá)水平，還可使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間維持高表達(dá)水平。6、載體：用多孔微載體替代常規(guī)載體細(xì)胞易受機(jī)械攪拌和噴氣損傷。4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)二細(xì)胞死亡與凋亡： 細(xì)胞系在生物反響器中死亡主要是細(xì)胞凋亡。 bel-2基因的過(guò)量表達(dá)：能抑制Gln或缺氧引起的細(xì)胞調(diào)亡、減少細(xì)胞特定成分的消耗、提高細(xì)胞密度和目的蛋白的產(chǎn)量。可通過(guò)基因工程方法將bel-2這種抑制細(xì)胞調(diào)亡的基因?qū)爰?xì)胞。 在大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞死亡或凋

35、亡主要是：營(yíng)養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多。4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 三培養(yǎng)基與細(xì)胞系： 培養(yǎng)基：歷經(jīng)天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基到現(xiàn)今的無(wú)血清培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基：防止了血清的批次、質(zhì)量、成分等對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn)品純化等不良影響。 細(xì)胞系或細(xì)胞珠不同，其無(wú)血清培養(yǎng)基需求不同，在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段，細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性往往是特異性的。4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 四過(guò)程監(jiān)控： 因大量細(xì)胞的代謝，培養(yǎng)環(huán)境會(huì)迅速改變，過(guò)程的再線監(jiān)控是非常重要的。 離線測(cè)定：需要時(shí)間長(zhǎng)，來(lái)不及指導(dǎo)控制有關(guān)參數(shù)和培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、頻繁取樣易污染和增加費(fèi)用。 在線測(cè)定：培養(yǎng)條件、

36、代謝產(chǎn)物、目的產(chǎn)物等是大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的需要。 重要有效參數(shù)：溫度、pH、溶解氧濃度。 4.2.8 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程目前存在的問(wèn)題： 1.細(xì)胞密度低，產(chǎn)物濃度低。 2.細(xì)胞群體在大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)物能力易喪失，或產(chǎn)物活性易降低。 3.培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。 4.目前對(duì)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究比較欠缺。 5.在線監(jiān)測(cè)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)。4.2.8 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 今后應(yīng)重點(diǎn)開(kāi)展的工作： 1.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中代謝和產(chǎn)物形成機(jī)制等方面的理論研究。 2.開(kāi)發(fā)高密度生長(zhǎng)、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。 3.開(kāi)發(fā)細(xì)胞性能優(yōu)良

37、、細(xì)胞解離容易，并能重復(fù)使用的新型廉價(jià)的微載體。 4.研制高效的培養(yǎng)模式與系統(tǒng)，包括新型的無(wú)菌生物反響器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進(jìn)的在線監(jiān)測(cè)、分析與自動(dòng)控制技術(shù)等。 5.相關(guān)基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研究。4.3 組織工程4.3.1 概述4.3.1.1 組織工程： 組織工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將人體的某局部組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)、繁殖、擴(kuò)增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而到達(dá)器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。 4.3.1.2 修復(fù)缺損器官的方法 修復(fù)缺損器官： 1、自體移植：“拆東墻補(bǔ)西墻增加患者痛苦、有的器官獨(dú)一無(wú)二而無(wú)法移植。 2、異體移植：最

38、難解決免疫排斥反響，失敗率極高；異體器官來(lái)源有限，供不應(yīng)求，難以實(shí)施移植。動(dòng)物器官移植同樣存在免疫排斥反響，且有將動(dòng)物的一些病毒傳染給人類的危險(xiǎn) 3、組織代用品：如硅膠、不銹鋼、金屬合金等，致命弱點(diǎn)是與人體組織相容性差，不能長(zhǎng)久使用，還易引起感染。4.3.1.3 組織工程修復(fù)缺損器官 采用相容性好的生物可降解材料制成的各鐘三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體支架，在細(xì)胞增殖過(guò)程中，提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氧和二氧化碳交換，排泄廢料，而自身逐漸被人體降解、吸收、排泄，最后形成有特定形態(tài)和功能的組織和器官。 其優(yōu)勢(shì)明顯、應(yīng)用前景誘人：運(yùn)用生物工程技術(shù)，利用人體剩余器官的少量正常細(xì)胞進(jìn)行體外繁殖，既可獲得患者急需的具有

39、相同功能的器官，又無(wú)排斥反應(yīng)，現(xiàn)已取得滿意的成果。 4.3.1.4 組織工程現(xiàn)狀 1、在進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的再生的和實(shí)驗(yàn)室培育的器官：骨骼、軟骨、血管、皮膚、胚胎期的胎兒神經(jīng)組織。 2、正在實(shí)驗(yàn)室里生長(zhǎng)成形的：肝臟、胰臟、心臟乳房、手指、耳朵等。 3、人們甚至正在嘗試：培育能充當(dāng)藥物釋放渠道的組織。4.3.2 組織培養(yǎng)4.3.2.1 上皮組織的體外培養(yǎng) 1.體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)特性 2.表皮組織的體外培養(yǎng)4.3.2.2 肌肉組織的體外培養(yǎng) 1.肌肉組織的特點(diǎn) 2.骨骼肌的培養(yǎng)4.3.2.3 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)4.3.2.1 上皮組織的體外培養(yǎng)一、體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)特征： 1、體內(nèi)上皮組織細(xì)

40、胞：排列緊密、形態(tài)較一致、有極少量的細(xì)胞間質(zhì)、被覆上皮分為單層和復(fù)層上皮 2、體外培養(yǎng)時(shí)： 1局部保存體內(nèi)生長(zhǎng)的特征：成群存在或緊密相連成單層膜，極少離群獨(dú)存，表現(xiàn)群體依賴性 。 2接觸抑制：培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)胞增多成片后，運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)受到抑制。 4.3.2.1 上皮組織的體外培養(yǎng)二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 表皮細(xì)胞：角質(zhì)形成細(xì)胞角蛋白細(xì)胞，占絕大多數(shù)和非角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量不多，更新慢。 角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)較經(jīng)典的方法飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法Rheinwald 和Green, 1975： 1、原理及優(yōu)點(diǎn)：將別離的角質(zhì)形成細(xì)胞種植在經(jīng)過(guò)處理的小鼠3T3滋養(yǎng)細(xì)胞形成的飼養(yǎng)層上，以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化；

41、細(xì)胞接種密度抵、增殖快、生長(zhǎng)穩(wěn)定、傳代較好。4.3.2.1 上皮組織的體外培養(yǎng)二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 2、實(shí)驗(yàn)材料： 表皮細(xì)胞來(lái)源：外科手術(shù)取包皮、乳腺、腹部皮膚，流產(chǎn)胎兒皮膚最好，燒傷的依情況定。 飼養(yǎng)層細(xì)胞：瑞士小鼠胚胎瘤的成纖維細(xì)胞系3T3，能有力促進(jìn)表皮細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，抑制混入的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。 3T3細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM加10%胎牛血清、4 mmolL谷氨酰胺、青霉素100 IUml、鏈霉素100 g ml。 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM和F12 (31)加10%胎牛血清、4 mmolL谷氨酰胺、青100IUml、鏈霉素100 g ml、5 g ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5g ml胰島素等。

42、3、培養(yǎng)過(guò)程： 13T3細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：小鼠胚胎瘤成纖維細(xì)胞系3T3 PBS平衡液洗滌 胰蛋白酶-EDTA消化 細(xì)胞變圓顯微鏡下觀察 棄消化液，加角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液消化液體積的3倍吹打分散細(xì)胞接種培養(yǎng)，35天發(fā)生融合接近融合成單層時(shí)傳代培養(yǎng)。 2飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：3T3細(xì)胞覆蓋瓶底一半時(shí)換培養(yǎng)液培養(yǎng)24h 接近融合加110 g ml絲裂霉素C，培養(yǎng)12h 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次胰蛋白酶消化種植在培養(yǎng)瓶中加角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液37培養(yǎng)貼壁后12h再種植角質(zhì)形成細(xì)胞。 3角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代：取材消毒、別離皮膚和皮下組織，切成23mm小快中性蛋白酶消化4 過(guò)夜或37 24h針頭分開(kāi)表皮薄而半透明與真

43、皮胰蛋白酶消化、離心、培養(yǎng)細(xì)胞覆蓋70%瓶底那么傳代。 4、結(jié)果分析： 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)35天后開(kāi)始形成集落、擴(kuò)展； 10天左右集落融合形成皮片，細(xì)胞增速減慢； 3T 3漸被排擠，形成整個(gè)皮片時(shí)，3T3細(xì)胞消失。4.3.2.2 肌肉組織的體外培養(yǎng) 4.3.2.2.1 肌肉組織的特點(diǎn)： 又稱肌組織，來(lái)自于中胚層具收縮能力的肌細(xì)胞。肌細(xì)胞間有少量的結(jié)締組織、豐富的血管和神經(jīng)。 肌肉組織培養(yǎng)：肌肉組織植快或分散的肌細(xì)胞在離體環(huán)境中存活、生長(zhǎng)或發(fā)育。肌肉細(xì)胞富含肌原纖維具收縮能力，故培養(yǎng)方法上有其特殊性。 骨骼肌細(xì)胞：中胚層細(xì)胞分化成肌細(xì)胞有絲分裂融合肌管細(xì)胞長(zhǎng)條管狀，十多個(gè)核串珠狀排列中間肌原纖維增

44、加，核向周邊移動(dòng)骨骼肌細(xì)胞。 肌衛(wèi)細(xì)胞：乃骨骼肌細(xì)胞的干細(xì)胞可被看作儲(chǔ)藏的成體細(xì)胞。緊貼骨骼肌細(xì)胞外表，扁平，有突起能進(jìn)行有絲分裂。肌肉受傷后，肌衛(wèi)細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞，進(jìn)一步分化為肌纖維，填補(bǔ)受傷部位。 成熟的骨骼肌細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂。 4.3.2.2.2 骨骼肌的培養(yǎng)： 1、材料：組織來(lái)源胚胎或新生12天最好大鼠大腿肌肉；培養(yǎng)液Eagle MEM或DMEM添加FCS或和馬血清、雞胚液。 2、培養(yǎng)過(guò)程：1處死動(dòng)物，別離大腿肌肉，洗滌，胰蛋白酶消化，收集懸浮細(xì)胞。2接種在10% CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。3取原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞記數(shù)，接種在明膠覆蓋的培養(yǎng)板上，進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)。3、骨

45、骼肌培養(yǎng)的結(jié)果： 接種數(shù)小時(shí)后多數(shù)細(xì)胞貼壁，主要為單核外觀明顯細(xì)胞；前2天是細(xì)胞增殖的主要時(shí)期，無(wú)明顯細(xì)胞融合；5052 h后，細(xì)胞進(jìn)入快速融和期；多核細(xì)胞快速生長(zhǎng)導(dǎo)致纖維網(wǎng)的形成；數(shù)天后融合結(jié)束，之后可觀察到纖維的自發(fā)收縮現(xiàn)象；再過(guò)12天，骨骼肌細(xì)胞的特征橫紋開(kāi)始變得明顯；有時(shí)肉眼可見(jiàn)到細(xì)胞收縮；適當(dāng)條件下，細(xì)胞增殖一代時(shí)間為1113 h。 肌肉細(xì)胞系的建立：肌細(xì)胞的連續(xù)選擇性傳代，低密度接種到有或無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板上，形成單細(xì)胞克隆，可以防止肌源性表型的過(guò)早喪失。不同組織來(lái)源的細(xì)胞連續(xù)傳代會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)增殖活動(dòng)停止，也有肌源性表型喪失的趨勢(shì)4.3.2.3 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)元細(xì)

46、胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成神經(jīng)組織。即體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 培養(yǎng)對(duì)象、條件、設(shè)備等不同，培養(yǎng)方法不同。 差速處理富集脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)法： 1、材料： 動(dòng)物：胚齡14天的大鼠胚胎； 培養(yǎng)液：1含血清的培養(yǎng)液：DMEM加20%胎牛血清、50 IUml的青霉素、50g ml 的鏈霉素2無(wú)血清的培養(yǎng)液：DMEM 加5g ml 牛胰島素、50 g ml 人轉(zhuǎn)鐵蛋白。3多聚賴氨酸液。4.3.2.3 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)2、培養(yǎng)步驟： 1取大鼠胸、腰段脊髓，剔除脊膜，顯微鏡下別離暗灰色組織，剪碎； 237 0.25%胰蛋白酶消化15 min，胎牛血清終止酶活性后，離心、懸浮、吹打，再離心，制得細(xì)胞懸浮液

47、； 310ml 細(xì)胞懸液于直徑100mm培養(yǎng)皿中， 37、5%的CO2 孵育23h，利于最大限度貼壁； 4未貼壁的細(xì)胞離心，重新獲得細(xì)胞懸浮液，記數(shù)； 5用多聚賴氨酸液預(yù)先包被培養(yǎng)皿 37 24h，每皿接種106個(gè)懸浮細(xì)胞； 6CO2 培養(yǎng)箱孵育2h，換無(wú)血清化學(xué)限制培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，4天后換液。4.3.2.3 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)3、結(jié)果： 用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定證實(shí)，大約98%的細(xì)胞是神經(jīng)元性質(zhì)的細(xì)胞。 因材料來(lái)源于胚胎組織，所以培養(yǎng)物中還有少量的神經(jīng)前體細(xì)胞。 硼酸鹽緩沖液配制的多聚賴氨酸生長(zhǎng)基質(zhì)，其效果好于蒸餾水。 4.4 器官培養(yǎng)4.4.1 概述： 1、器官培養(yǎng)：主要采

48、用類似于組織培養(yǎng)中植塊培養(yǎng)的方式培養(yǎng)器官型植塊。 2、根本技術(shù)特點(diǎn)：取出動(dòng)物器官或進(jìn)一步修整成器官型植塊，將其接種到培養(yǎng)基上或培養(yǎng)液中，在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)、氣相、生長(zhǎng)基質(zhì)等條件下，使其存活和生長(zhǎng)。 3、開(kāi)展歷史：最早Leob1897年進(jìn)行成年兔一些器官的嘗試性培養(yǎng)血漿凝快培養(yǎng)兔的肝、腎、甲狀腺、卵巢等3天；20世紀(jì)初器官培養(yǎng)進(jìn)入活潑時(shí)期主要限于胚胎器官；20世紀(jì)50年代進(jìn)入蓬勃開(kāi)展階段不限于胚胎器官，技術(shù)、器皿、培養(yǎng)基等有了許多改進(jìn)和革新。4.4 .1 器官培養(yǎng)概述 迄今，文獻(xiàn)報(bào)道已在培養(yǎng)的人體器官：乳腺、眼、內(nèi)耳、肝、腦、角膜、腎、肺、骨、皮膚、子宮、胸腺、腸、牙、氣管、副甲狀腺、心臟、食管等等。

49、 4、現(xiàn)代器官培養(yǎng)的共同點(diǎn)： 1培養(yǎng)對(duì)象：非胚胎和胚胎器官的一局部； 2浸泡在培養(yǎng)液中培養(yǎng)； 3被培養(yǎng)組織器官的細(xì)胞以簡(jiǎn)單擴(kuò)散方式獲得氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、排除CO2和其他代謝廢物。 4.4 .1 器官培養(yǎng)概述5、器官培養(yǎng)的特征： 器官培養(yǎng)與器官保存、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)不同： 1被培養(yǎng)器官存活較長(zhǎng)時(shí)間，保持相對(duì)正常功能，器官內(nèi)的細(xì)胞有正常功能甚至增殖。器官保存無(wú)細(xì)胞增殖。 2被培養(yǎng)物是完整器官或具有完整功能的某一器官的一局部。如肝、肺的一葉，一片皮膚等。組織培養(yǎng)物已喪失原器官的完整功能。 3器官培養(yǎng)無(wú)器官數(shù)量的增加。細(xì)胞培養(yǎng)有細(xì)胞數(shù)量的增加。 胚胎與成體器官培養(yǎng)的特點(diǎn)1、根本原那么： 1提供充足

50、的營(yíng)養(yǎng)和O2，及時(shí)排除代謝廢物； 2抑制細(xì)胞從植快向外遷移。2、胚胎器官培養(yǎng)的特點(diǎn)： 1能量來(lái)源是糖酵解，培養(yǎng)時(shí)不需補(bǔ)充O2。 2早期胚胎器官原基體積較小，可將整個(gè)器官進(jìn)行培養(yǎng)。 3胚胎器官細(xì)胞生長(zhǎng)活潑，遷移能力強(qiáng)，容易從植快中遷移出來(lái)。 胚胎與成體器官培養(yǎng)的特點(diǎn)3、成體器官培養(yǎng)的特點(diǎn)： 1能量來(lái)自有氧代謝，因此需充足的O2供給，器官植塊中心才不會(huì)缺氧而壞死。只能成功培養(yǎng)幾周，且僅能維持其存活和保持其結(jié)構(gòu)功能因其高耗氧率和細(xì)胞的高度分化。器官內(nèi)部細(xì)胞遷移不明顯。 4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法1、表玻璃器官培養(yǎng)法： ell 和 Robinson1929建立。表玻璃上加雞胚質(zhì)和雞血漿凝固培養(yǎng)的器

51、官移植其上放入培養(yǎng)皿內(nèi)入箱培養(yǎng)。 已成功用于研究胚胎原基的形態(tài)發(fā)生，改進(jìn)后可用于激素、維生素、致癌因子對(duì)哺乳動(dòng)物成年器官的作用等方面的研究。4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法2、瓊脂凝膠培養(yǎng)法： 培養(yǎng)液加瓊脂形成凝膠，故培養(yǎng)基質(zhì)不液化，器官組織的細(xì)胞在其上的遷移受到抑制。 用此法成功進(jìn)行了胚胎器官的發(fā)育及形態(tài)發(fā)生的研究，以及腫瘤組織的培養(yǎng)。4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法3、懸浮培養(yǎng)法： 是最簡(jiǎn)便最早使用的液體培養(yǎng)法，可隨時(shí)加影響因子或生化分析瓊脂凝膠培養(yǎng)法只有在轉(zhuǎn)培養(yǎng)時(shí)才能進(jìn)行。 器官型植塊置于液體培養(yǎng)基中，適當(dāng)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，以使液面的氧盡可能多地溶解在培養(yǎng)液中，并防止植快下沉而黏附。4.4.3 傳

52、統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法4、直接漂浮培養(yǎng)法： 器官浸入培養(yǎng)液中，不能持續(xù)接觸空氣O2易于缺氧壞死。 器官型植塊置于液體培養(yǎng)基與氣象界面上培養(yǎng)，植塊可同時(shí)獲取營(yíng)養(yǎng)和充足的氧氣。 此法適合于高耗氧的成體器官的培養(yǎng)。如皮膚表皮向上、真皮向下直接漂浮在培養(yǎng)液外表，并向培養(yǎng)液中充入70%的O2 ，獲成功Medarwar,1948。4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法5、擦鏡紙培養(yǎng)法： 直接漂浮培養(yǎng)法的缺乏：器官易轉(zhuǎn)曲。 最早的在氣液外表進(jìn)行器官培養(yǎng)的方法。 擦鏡紙具有疏水性漂浮在培養(yǎng)液的外表，作為器官的支持物，營(yíng)養(yǎng)物可透過(guò)擦鏡紙進(jìn)入器官。4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法6、金屬格柵器官培養(yǎng)法： 漂浮支持物很難持久地漂浮

53、。 金屬格柵替代漂浮支持物Trowell,1954。 最初為高耗氧的成體器官培養(yǎng)而設(shè)計(jì)。 金屬格柵：堅(jiān)實(shí)、平穩(wěn)、平安，支托或移動(dòng)大量的培養(yǎng)器官。4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法7、瓊脂小島器官培養(yǎng)法： 瓊脂制成小島狀的支持物，放在液體培養(yǎng)基中，將器官置于瓊脂上進(jìn)行培養(yǎng)。瓊脂起支持和防止培養(yǎng)器官的細(xì)胞發(fā)生遷移的作用。 優(yōu)點(diǎn)：可直接觀察器官的生長(zhǎng)情況；維持器官在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞遷移瓊脂凝膠培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)；換液簡(jiǎn)便液體培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)。4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法8、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法： 最早于1933年Gey建立。 要培養(yǎng)的器官植塊用血漿凝塊固定于旋轉(zhuǎn)管一側(cè)，管內(nèi)參加適量培養(yǎng)液，水平旋轉(zhuǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)期間，植塊斷續(xù)地與培養(yǎng)液和氣相接觸，可獲得充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法9、搖擺式器官培養(yǎng)法： 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法雖是動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，但操作復(fù)雜。 1976年Barret等創(chuàng)立搖擺式器官培養(yǎng)法：采用平臺(tái)式搖擺儀使培養(yǎng)的器官植塊交替地浸入培養(yǎng)液和暴露于混合氣體環(huán)境中，還能迅速去除器官的代謝產(chǎn)物，器官的存活時(shí)間較長(zhǎng)。4.4.4 現(xiàn)代器官培養(yǎng)灌流式器官培養(yǎng)法 培養(yǎng)系統(tǒng)的特征： 采用一個(gè)連有