1、結核病鑒別診斷相關實驗室檢測項目樂 軍上海市結核病重點實驗室同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院題 綱1.結核與肺癌鑒別診斷相關實驗室檢測2.結核與不典型肺部感染相關實驗室檢測3.結核與肺部真菌感染相關實驗室檢測4.結核與肺吸蟲感染相關實驗室檢測5.T-SPOT技術在結核鑒別診斷中應用價值第一.結核與肺癌鑒別診斷相關實驗室檢測Diagnosis of Primary Tumor原發(fā)性腫瘤的診斷Sputum Cytology痰液脫落細胞學Flexible Bronchoscopy and Biopsy纖維支氣管檢測TTNA transthoracic needle aspiration 經(jīng)皮肺穿刺Cell

2、 Type Accuracy細胞分型準確性中央的病變、支氣管鏡檢查是確定惡性腫瘤診斷的最靈敏的方法。小的（ie, 70單位-診斷如果胸膜液干擾素高-診斷胸膜活檢肉芽腫-診斷如果淋巴細胞的滲出液和PPD陽性，如果胸膜液ADA超出40，對結核病胸膜炎治療如果淋巴細胞的滲出物和陰性的PPD， 5周后重新試驗PPD，如果陽性治療。第二，結核與不典型肺部感染相關實驗室檢測社區(qū)獲得性肺炎的診斷CAP的癥狀特點 1.細菌急性發(fā)作，高燒、咳嗽，膿性痰，CRP濃度高，典型臨床的發(fā)現(xiàn)和X ray2. 非典型 起病緩慢，發(fā)燒（常常沒有咳嗽）、痰液少見或沒有、低到中度CRP水平、無特異性的臨床的發(fā)現(xiàn)、 X光顯示肺炎社

3、區(qū)獲得肺炎（CAP）細菌肺炎鏈球菌，嗜血桿菌、莫拉氏菌屬、革蘭氏陰性桿菌，其它非典型“肺炎支原體、衣原體、軍團菌、病毒非典型肺炎的致病因子Mycoplasma pneumoniae肺炎支原體Chlamydia pneumoniae肺炎衣原體Legionella sp.軍團菌Viruses病毒肺炎支原體每45年爆發(fā)流行可檢測散在病例主要兒童和青年人肺炎支原體診斷病原體直接檢測培養(yǎng)抗原檢測DNA 檢測 (PCR)抗體檢測病原體直接檢測培養(yǎng)慢,敏感性低抗原檢測未廣泛使用,敏感性低DNA 檢測 (PCR)非常有希望主要問題是符合要求標本抗體檢測補體結合反應 (CBR)抗體滴度4倍升高最靈敏和最特異酶聯(lián)

4、免疫檢測 (EIA)IgG, IgA, IgM 種類根據(jù)不同試驗廠家，結果有差異。EIA 試驗的比較不同的廠商5種試劑盒所有血清檢測IgG、IgA, IgM抗體一組CBR陽轉和CBR陰性的血清結 果敏感性IgA 68-97%, IgM 87-97% 特異性IgA 76-100%, IgM 60-99%陽性預測值PPVIgA 91-99%, IgM 90-99%陰性預測值NPVIgA 50-90%, IgM 78-91%EIA試驗缺陷高靈敏度結合低特異性，反之亦然沒有一個廠家IgA和IgM兩者檢測都具有高品質第一個標本檢測可正確診斷大約40%的病例結 論 (支原體)仔細的選擇廠商并且使用試劑是非

5、常重要。沒有一種方法是十全十美，高靈敏度具有低特異性。第一標本檢測可診斷40%病例。肺炎衣原體常見于老年人，導致其它的疾病患者并發(fā)癥。局部地爆發(fā)，沒有典型的周期性。多數(shù)病例是散在的。肺炎衣原體診斷病原體直接檢測培養(yǎng)抗原檢測DNA 檢測 (PCR)抗體檢測病原體直接檢測培養(yǎng)困難抗原檢測特異性和敏感性低DNA 檢測 (PCR)非常有希望主要問題是符合要求標本抗體檢測EIA酶免疫屬特異的、在感染初期靈敏較差、疾病痊愈后一段時間檢出抗體Imunofluorescent test (MIF)免疫熒光金標準，耗時間和費力Immunoblott免疫印跡驗證方法免疫印跡檢測急性感染的結果一組有臨床的和微生物學

6、的標志，急性的肺炎衣原體感染患者43份血清一致結果 (MIF and IB)63%免疫印跡陰性或臨界IgA21%IB 陰性, MIF 陽性16%恢復期患者血樣結果證明診斷C. trachomatis 呼吸道感染患兒 (6) 100%慢性的衣原體感染免疫印跡檢測結果檢測一組80份若干月持續(xù)IgG和IgA MIF肺炎衣原體抗體血清IB 陽性 IgG and IgA31%IB 陽性 僅僅IgG 51%IB 陰性 18%抗體不是疾病，沒有相應疾病抗體水平治療是嚴重的錯誤。導致不合理使用抗生素和抗生素耐藥性增加。結 論 (衣原體)IB免疫印跡是一種驗證方法。IB 敏感性比MIF低（急性感染早期可能為陰性

7、)。結果的解釋應該根據(jù)實驗室和臨床資料以及患者病史。所謂持續(xù)感染是診斷的問題。只有長期患者隨訪和重復測試才有幫助。結 論肺炎支原體和肺炎衣原體的診斷主要依靠抗體檢測試驗。培養(yǎng)和 PCR有其各自局限性 (符合要求標本)仔細選擇試驗以及利用臨床資料合理解釋結果似乎是主要的。沒有解釋，結果造成誤導。第三，結核與肺部真菌感染鑒別診斷相關實驗室檢測檢驗特點形態(tài)學檢查為檢測真菌的重要手段抗原檢測適合血清和腦脊液中隱球菌、念珠菌、莢膜組織胞漿菌。血清學診斷適用于深部真菌感染。檢測程序標本直接鏡檢抗原檢出分離培養(yǎng)不染色乳酸酚棉藍染色墨汁染色氫氧化鉀消化后涂片鏡檢二相性真菌腦心浸液腦心浸液沙氏培養(yǎng)基病原性真菌血

8、瓊脂平板觀察菌落性狀和菌絲孢子形態(tài)顯微鏡檢查-濕片法或直接涂片高倍視野鏡檢，見有菌絲孢子或單細胞真菌（有診斷價值，但不能確定真菌種類）真菌的菌落-真菌分類重要的依據(jù) 真菌的菌落一般是指在一定基質上，接種某種真菌的一個孢子或一段菌絲，經(jīng)過培養(yǎng)，向四周蔓延生長出絲狀的群體稱為真菌菌落。菌落呈放射狀生長，因而菌落外周的生命力最旺盛。在不同成分的培養(yǎng)基上和不同條件下培養(yǎng)，同一種真菌，形成的菌落也有差別。因此，菌落的形態(tài)觀察是指在固定的條件下，菌落所表現(xiàn)的形狀、大小、色澤和結構等。不同的真菌菌落所表現(xiàn)特征差別顯著，它為真菌分類工作提供了重要的依據(jù)。菌落顏色除酵母菌的菌落比較簡單，絲狀真菌的菌落形態(tài)各種各

9、樣。常以下述特征加以描述。其顏色的多樣很難用色澤描述，常借助于色譜加以鑒別。很多真菌產(chǎn)生多種顏色的色素，使菌落的背面染有顏色，有的甚至分泌可溶性色素，擴散到全部基質中去。菌落質地氣生菌絲構成表面菌絲體質地。底部菌絲體埋伏于培養(yǎng)基中或緊貼培養(yǎng)基表面向四周蔓延，由底部體直接生出分生孢子梗，菌落外觀呈短茸毛狀，由底部菌絲體生出氣生菌絲，再由它生出分生孢子梗，因而往往有纏繞的氣生菌絲團，一般菌落較厚，呈絮狀。也有部分氣生菌絲扭結成繩索、還有分生孢子梗自底部菌絲成束地生長，在菌落的外觀上成粒狀或粉狀。有些真菌產(chǎn)生子實體或菌核，則菌落表面呈顆粒結構。有的菌落出現(xiàn)同心環(huán)或輻射狀溝紋。有的真菌只在菌落中間區(qū)域

10、生出分生孢子頭，邊緣菌絲則不生育。菌落的大小也大有不同，有些種的菌落可蔓延擴展到整個培養(yǎng)基，而另一些種的菌落則局限生長。真菌菌落外觀結構描述菌落表面平滑或具皺紋、致密或疏松、同心環(huán)或輻 射狀溝紋等；菌落質地絨毛狀、氈狀、棉絮狀、羊毛狀、束狀、繩索狀、粉粒狀、明膠狀或皮革狀等；菌落的邊緣可呈全緣、鋸齒狀、樹枝狀或纖毛狀等；菌落高度扁平、丘狀隆起、中心部分突起或凹陷等。 193 patients (392 samples); 43 with ICSensitivity SpecificityMannan (ag)40 %98 %Antimannan (ab)53 %94 %ag and/or ab

11、80 %93 % （一）抗原：甘露聚糖Detection of Mannan/Antimannan in Serum of Patients with Invasive CandidiasisSendid B et al, J Clin Microbiol 1999;37:1510-7（二）抗原：半乳甘露聚糖Serial Aspergillus Galactomannan Screeningn = 362 high-risk neutropenic patientsSandwich ELISA 2 times weekly, 11.7% positiven = 30 proven IAn =

12、9 probable IAn = 264 with no IASensitivity89.7%Specificity98.1%PPV87.5%NPV98.4%Maertens J et al, Blood 2001;97:1604-10GM抗原檢測用于侵襲性曲霉病診斷與臨床診斷和療效反應有良好的一致性。檢測方法有ELISA、放射免疫分析（RIA）和乳膠凝集試驗等，但敏感性低。ELISA檢測24只兔(王莉，等。2003 ) 敏感性和特異性： 血清 95% 78% 尿液 90% 51.4%檢測曲霉GM抗原的ELISA試驗GM抗原ELISA檢測方法（Platelia試劑盒）48例患者：確診IA 4例

13、，3例陽性；高度懷疑IA 13例，8例陽性；可疑IA 31例，2例陽性。 靈敏性為64.7%特異性為93.5%假陽性率為6.5%假陰性率為35.3%（三）新生隱球菌乳膠凝集試驗（四）-1,3葡聚糖使用儀器及配套試劑盒能快速地檢測出血液和體液中真菌-1,3葡聚糖的實際含量，對真菌的早期診斷具有重要意義。 -1,3-D-葡聚糖檢測陰性是否需要作進一步的復查？ Furuya的報道即使是確診的深部真菌感染患者,-1,3-D-葡聚糖檢測也有可能是陰性,因此單次-1,3-D-葡聚糖檢測陰性并不能排除深部真菌感染的可能，必須在疾病的過程中重復進行-1,3-D-葡聚糖檢測。 Furuya T et al. U

14、sefulness of -D-glucan measurement for diagnosis of deep mycosis, Jnp J Antibiot 1993; 46(6):437-443確診深部真菌感染病人病史調(diào)查臨床表現(xiàn)及影像學檢查:1)發(fā)熱、咳嗽、痰血10余天 2) 抗生素治療效果不佳 3) 胸部CT檢查,發(fā)現(xiàn)左肺陰影 支氣管鏡活組織檢查:找見真菌真菌分子生物學的鑒定方法核酸堿基GC比分析限制性片段長度多態(tài)性Southern印跡分析脈沖場凝膠電泳（PFGE）PCR隨機擴增多態(tài)性 (RAPD)DNA片段測序等分子流行病學研究Yu J，et al. Mycopathologia,

15、 2004.引物OPI07 RAPD擴增結果 引物OPK20 RAPD擴增結果 IGS區(qū)擴增結果真菌感染檢查項目的選擇和應用淺部真菌直接顯微鏡檢查深部真菌標本培養(yǎng)、觀察培養(yǎng)物性狀并借助理化特性作鑒別。Direct Examination It is highly recommended that a direct microscopic examination be made on most this provide an immediate presumptive diagnosis for the physician, but it may also aid in the selectio

16、n of an appropriate culture medium. A phase-contrast microscope is a valuable adjunct in the direct examination of specimens. The advantages include the following:1)mounts can be made and examined quickly;2)there is no need for direct staining;and3)the objects can be clearly visualized.Tests for det

17、ection of fungal antibodies(1)Determination of antibody and/or antigen titers may be useful in diagnosing fungal infections and when performed in a serial fashion also provide a means of monitoring the progression of disease and the patients response to therapy .With the exceptionof antibody tests f

18、or histoplasmosis and occidioidomycosis, however,most tests designed to detect an antibody response as a means of diagnosing invasive fungal infections lack sensitivity and specificity,are poorly standardized and are not widely availableTests for detection of fungal antibodies(2)Tests for detection

19、of fungal antibodies(3)Antibody tests for Candida and Aspergillus. Are often unable to distinguish active from past infection and Colonization from transient fungemiaTests for detection of fungal antibodies(4) In addition,a negative test for fungus-specific antibodies does not rule out infection bec

20、ause imunocompromised patients, and some individuals with disseminated infection may not mount an antibody response to the infecting organism .Tests for detection of fungal antigens(1) Detection of fungal antigens or metabolites in serum or other body fluids represents the most direct means of provi

21、ding a serologic diagnosis of invasive fungal infection .Both the RIA and the EIA tests have been shown to be rapid,sensitive, specific, rapid ,and reproducible. Tests for detection of fungal antigens(2)Although significant advances have been made in recent years,most methods for rapid detection of

22、fungal antigens are available only in research laboratories .Notable exceptions are the tests for detection of the polysaccharid ride antigens of C.neoformans and H.capsulatumd .Tests for detection of fungal -specific nucleic acid sequences(1)The use of the PCR to detect fungal nucleic acids directl

23、y in clinical material offers great promise for the rapid diagnosis of fungal infections .Tests for detection of fungal -specific nucleic acid sequences(2)In addition to detection of fungal pathogens in clinical terid,immunologic and molecular approaches have been applied successfully to the identif

24、ication of fungi in culture .第四，結核與肺吸蟲感染相關實驗室檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲Paragonimus westermani （肺吸蟲）一. 形 態(tài)(一) 成蟲形態(tài)特征: 1. 外部形態(tài): （1）形狀 橢圓形 肥厚 背隆起 腹扁平 半粒黃豆狀 （2）大小 長7.5 12 mm 寬46mm （3）顏色 活時半透明肉紅色 固定后灰白色 （4）口、腹吸盤位置及大小比例 ： 口吸盤：前端 腹面 與腹吸盤大小相仿 腹吸盤：腹中橫線稍前2. 內(nèi)部結構: (1)生殖系統(tǒng) 雌雄同體 特征 “并列排列” 雄性生殖系統(tǒng) 1對睪丸邊緣分支 左右并列于 蟲體后1/3處 雌性生殖系統(tǒng) 卵巢分葉

25、 子宮管狀彎曲盤繞內(nèi) 含蟲卵 二者左右并列 (2)消化系統(tǒng) 同概論 但2支腸管呈螺旋狀彎曲肺 吸 蟲 成 蟲肺 吸 蟲 蟲 卵二. 生活史(一) 發(fā)育過程:蟲卵糞便入水川卷螺毛蚴胞蚴母子 雷蚴尾蚴出螺入水淡水蟹、 喇蛄囊蚴（ 肺） 成 蟲人食入 童蟲成蟲 第一中間宿主 （無性增殖）第二中間 宿主 終宿主（有性生殖）肺吸蟲囊蚴脫囊而出 川 卷 螺（二） 生活史要點1.宿主關系: 第一中間宿主:川卷螺 第二中間宿主:淡水蟹 喇蛄 終宿主:人 保蟲宿主:食肉動物如貓、犬、虎、豹、狼、狐等 轉續(xù)宿主:野豬等2.感染階段：囊蚴 感染途徑與方式：經(jīng)口感染,食入含囊蚴的淡水蟹、喇蛄而感染3.寄生部位（成蟲）

26、：肺 異位寄生部位:皮下組織 肝 腦 脊髓等處 成蟲壽命:一般56年 三. 致 病臨床分型: 1.胸肺型肺吸蟲病 似肺結核癥狀 2.腹型肺吸蟲病 3.腦型肺吸蟲病 4.皮下型肺吸蟲病 皮下多處結節(jié) 5.肝型肺吸蟲病 肺吸蟲寄生于肺四.實驗診斷 病原檢查：1.檢查階段：蟲卵或童蟲2.取材： 糞便 痰液3.方法：查蟲卵 (1)生理鹽水直接涂片法 (2)集卵法 氫氧化鈉消化法 查童蟲 皮下結節(jié)活組織檢查免疫學診斷五. 流行及防治關鍵因素: 當?shù)厝巳河猩郴虬肷澈因实?淡水蟹、喇蛄的習慣防治關鍵: 勿生食淡水蟹、喇蛄 生、熟食菜板要分開第五，T-SPOT技術在結核鑒別診斷中應用價值T-SPOT.T

27、B結核感染T細胞斑點實驗全球最準確的快速結核感染檢測效應T細胞的檢測干擾素釋放實驗原理：結核感染者體內(nèi)存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（ IFN- ）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。由于效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀。T-SPOT.TB技術利用結核桿菌感染者外周血單核細胞中存在結核特異的效應T淋巴細胞，這些淋巴細胞在受到結核桿菌特異抗原刺激后分泌IFN-而設計的T細胞免疫斑點試驗。利用高靈敏的酶聯(lián)免疫試驗(ELISPOT)檢測對結核菌特異的T淋巴細胞

28、的方法，為結核病快速診斷開辟了一條新的思路。檢測用的抗原ESAT-6、CFP-10 Mahairas等在1996年發(fā)現(xiàn)的一段存在結核分枝桿菌(簡稱結核桿菌)中名為“RD1”的基因序列，而在卡介苗菌株和大部分環(huán)境分枝桿菌的基因中則缺乏RD1序列。RD1編碼產(chǎn)生2種蛋白：ESAT-6（early secreted antigenic target 6）和CFP-10(culture filtrate protein 10)，ESAT-6和CFP-10作為特異性抗原刺激機體特異性T細胞產(chǎn)生IFN- 。BCG進化過程ELISPOT和結核特異抗原整合結核感染診斷技術T SPOT-TBELISPOT的靈敏

29、性決定了T SPOT-TB的靈敏性ESAT-6和CFP-10兩個抗原的特異性決定了T SPOT-TB的特異性檢測過程實際結果優(yōu)點特異性高：只針對結核分枝桿菌復合群敏感，對BCG和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌不敏感，特異性 99%。靈敏度高：對活動性結核及肺外結核，敏感性96%?？焖俸啽悖汉唵蔚膶嶒炇已簷z查，24小時報告結果。國外臨床應用總結-靈敏度ReferenceSensitivityJafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0% (12/12) Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3% (20/24) Lee

30、et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6% (84/87) Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3% (21/23) Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9% (70/73) Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*92.2% (59/64) Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3% (57/58) Clarke et al Clin Exp Immunol 2007

31、 150(2):238-44.90.0% (27/30) Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9% (26/28) Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-70392.9% (26/28) Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*80.8% (80/99) Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*85.7% (36/42) Chee et al J Clin Microbiol. 2008 Apr 9*94.1% (

32、254/270) Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8*84.6% (11/13) Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-887.2% (34/39) Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9100.0% (10/10) Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259100.0% (22/22) Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624*100.0

33、% (9/9) Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34*87.5% (42/48) Kobashi et al. J Infect. 2008 Epub ahead of print.*90.0% (36/40) Domnguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008.* Epub ahead of print84.2% (32/38) Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.*89.9% (62/69) Bosshard et al.

34、Respir Med. 2008. Epub ahead of print98.4% (62/63) Higuchi Med Microbiol Immunol. 2008. Epub ahead of print*95.9% (47/49) TOTAL92.0% (1139/1238) 國外臨床應用總結-特異性T-SPOT.TBGuidelinesNICE guidelinesSpecifically mentioned IGRAs for the following uses:Children (4 weeks to 2 years)NHS employeesContact tracing

35、New Entrants Draft Interim HPA GuidanceIn LTBI TST should be carried out first and those that are positive should be considered for IGRA testing if available. This would also apply to new entrant screening.IGRAs should be the only test used in the following situations:Where TST may be falsely negati

36、ve due to immunosuppressionWhen screening a large number of people as part of a public health investigations since repeated visits would be impracticalSpecific applications of IGRAs were mentioned:New health care workers should be tested with IGRAsIn pre-TNF alpha screening IGRAs may be a suitable a

37、lternative in BCG vaccinated subjects.Swiss Lung Association Bulletin 45/10These guidelines were issued in November 2005:Confirm positive Mantoux tests with a blood testUse only a blood test in immunocompromised subjectsChildren are excluded from being tested with blood testsIn December 2007 guidelines for TNF screening were released:All patients being considered for TNF therapy should be screened for LTBIScreening should be based on history, chest x-ray and IGRATST is no longer recommendedPatients with abnormal x-ray should further testing and be treated ac