1、雌激素誘導(dǎo)(yudo)miRNA-29表達(dá)(biod)在CCl4誘導(dǎo)大鼠肝損害中的保護(hù)(boh)作用背景：雌激素（estradiol，E2）緩解CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的潛在機(jī)制仍不清楚。結(jié)果：miRNA-29在CCl4處理的雌雄大鼠中的表達(dá)存在差異。E2和表達(dá)miRNA-29a/b的腺病毒可以增加肝內(nèi)miRNA-29a/b水平且緩解CCl4誘導(dǎo)肝纖維化。結(jié)論：E2通過誘導(dǎo)miRNA-29a/b抑制CCl4誘導(dǎo)肝損害。意義：了解miRNA-29對肝纖維化的作用/調(diào)控并提供新的治療靶點。摘要：以前研究表明雌性動物比雄性動物更容易耐受CCl4誘導(dǎo)肝纖維化，E2可以抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。然而，這種

2、現(xiàn)象的潛在機(jī)制仍沒有完全闡明。本研究報道E2誘導(dǎo)miRNA-29表達(dá)對CCl4誘導(dǎo)肝損害的作用。在用CCl4處理的雌雄大鼠中，肝內(nèi)miRNA-29表達(dá)存在差異。尤其在CCl4處理4周后的雄性而非雌性大鼠肝內(nèi)miRNA-29a 和miRNA-29b表達(dá)明顯下降。在雄性大鼠肝內(nèi)miRNA-29a 和miRNA-29b表達(dá)下調(diào)與肝纖維化進(jìn)展早期相關(guān)，結(jié)果顯示相對于雌性大鼠，雄性大鼠的纖維化標(biāo)志物表達(dá)增加。此外，在雌性大鼠E2比雄性大鼠一直保持更高水平。TGF-1在大鼠肝癌細(xì)胞IAR20和正常肝細(xì)胞中減少miRNA-29a/b表達(dá)。相反，E2通過抑制NF-B信號通路提高miRNA-29a/b表達(dá)，NF

3、-B信號通路負(fù)性調(diào)控miRNA-29表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)E2和靜注表達(dá)miRNA-29的腺病毒可以顯著增加miRNA-29a/b水平和緩解CCl4誘導(dǎo)肝損害大鼠的肝臟纖維化標(biāo)志物表達(dá)?？傊?，E2通過誘導(dǎo)肝內(nèi)miRNA-29抑制CCl4誘導(dǎo)肝損害。纖維化以過量沉積細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）為特征，尤其是膠原。肝纖維化是慢性肝病的一種常見結(jié)局，最終可能進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭。CCl4誘導(dǎo)肝纖維化與不同病因引起的人肝纖維化有一些共同特征；相應(yīng)地， CCl4誘導(dǎo)肝纖維化已作為纖維化模型 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_1 o Domeni

4、cali, 2009 #153 1-3。本課題目的是研究雌雄大鼠對CCl4的不同纖維化反映及E2抑制肝纖維化的潛在機(jī)制。以前研究已在動物中觀察到對非酒精性纖維化誘導(dǎo)因素（如CCl4）表現(xiàn)出性別差異 ADDIN EN.CITE Xu2002156415615617Xu, J.W.Gong, J.Chang, X.M.Luo, J.Y.Dong, L.Hao, Z.M.Jia, A.Xu, G.P.Estrogen reduces CCL 4-induced liver fibrosis in ratsWorld Journal of GastroenterologyWorld Journal o

5、f Gastroenterology883-8878520021007-9327 HYPERLINK l _ENREF_4 o Xu, 2002 #156 4，雌性動物相對于雄性大鼠更耐受CCl4誘導(dǎo)肝纖維化。通過研究這些差異，數(shù)個研究已證實E2抑制CCl4誘導(dǎo)肝纖維化動物模型具有保護(hù)作用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_5 o Liu, 2004 #158 5-7。Yasuda等 ADDIN EN.CITE Yasuda1999157615715717Yasuda, M.Shimizu, I.Shiba, M.Ito,

6、S.Second Department of Internal Medicine, School of Medicine, University of Tokushima, Tokushima, Japan.Suppressive effects of estradiol on dimethylnitrosamine-induced fibrosis of the liver in ratsHepatologyHepatology719-272931999/03/03AnimalsCell Differentiation/drug effectsCell Division/drug effec

7、tsCells, CulturedDimethylnitrosamineEstradiol/blood/*pharmacologyFemaleFibroblasts/cytologyLiver/cytology/drug effectsLiver Cirrhosis, Experimental/*chemically induced/*prevention & controlMaleMuscle, Smooth/cytologyRatsRats, WistarSex Characteristics1999Mar0270-9139 (Print)0270-9139 (Linking)100514

8、73Research Support, Non-U.S. Gov't/pubmed/1005147310.1002/hep.510290307eng HYPERLINK l _ENREF_6 o Yasuda, 1999 #217 6報道E2降低I型和II型前膠原以及金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）mRNA水平。也有研究發(fā)現(xiàn)在卵巢切除后的雌性大鼠，用E2替代治療抑制纖維化，而用E2特異性抗體或卵巢切除雌性大鼠中E2的保護(hù)作用消失，E2水平也明顯下降。Liu等 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_5 o Liu,

9、2004 #158 5報道17-E2緩解肝纖維化、改善肝功能（指標(biāo)為ALT和AST）。Shimizu等 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_8 o Shimizu, 1999 #160 8在大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC）中觀察到E2抑制肝纖維化的保護(hù)作用可能與抑制HSC激活有關(guān)。雖然已知E2作為強(qiáng)大的內(nèi)源性抗氧化劑，通過抑制活性氧化劑或間接調(diào)控細(xì)胞因子和其他生長因子的合成和釋放，達(dá)到抑制肝纖維化作用，但E2抑制肝纖維化的潛在機(jī)制仍沒有完全闡明。微小RNA（miRNA）是長約22nt的非編碼RNA，與細(xì)胞靶基因mRNA的3非編碼區(qū)序列

10、不完全互補(bǔ)配對調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá) ADDIN EN.CITE Bartel20041619-1116116117Bartel, D.P.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and functionCellCell281-297116220040092-8674Ambros200416216216217Ambros, V.The functions of animal microRNAsNatureNature350-355431700620040028-0836Esquela-Kerscher200616316316317Esquela-Ke

11、rscher, A.Slack, F.J.OncomirsmicroRNAs with a role in cancerNature Reviews CancerNature Reviews Cancer259-2696420061474-175X HYPERLINK l _ENREF_9 o Bartel, 2004 #161 9-11。以前研究已表明miRNA在細(xì)胞各個過程中起作用，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。大量研究報道m(xù)iRNA異常表達(dá)會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生發(fā)展。許多報道表明miRNA在HSC激活過程中起著重要的作用。對激活型大鼠HSC中miRNA表達(dá)分析證實了miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào) A

12、DDIN EN.CITE Guo20091641216416417Guo, C.J.Pan, Q.Cheng, T.Jiang, B.Chen, G.Y.Li, D.G.Changes in microRNAs associated with hepatic stellate cell activation status identify signaling pathwaysFEBS JournalFEBS Journal5163-51762761820091742-4658 HYPERLINK l _ENREF_12 o Guo, 2009 #164 12。也有研究證實過表達(dá)的miR-16和

13、miR-15通過下調(diào)線粒體相關(guān)抗凋亡蛋白Bcl-2，導(dǎo)致caspases3、8、9激活，從而抑制HSC增殖和誘導(dǎo)凋亡 ADDIN EN.CITE Guo20091651316516517Guo, C.J.Pan, Q.Li, D.G.Sun, H.Liu, B.W.miR-15b and miR-16 are implicated in activation of the rat hepatic stellate cell: An essential role for apoptosisJournal of hepatologyJournal of hepatology766-77850420

14、090168-8278 HYPERLINK l _ENREF_13 o Guo, 2009 #165 13。這些發(fā)現(xiàn)表明miRNA通過激活HSC在肝纖維化進(jìn)展中起著重要的作用。miR-29家族（包括關(guān)鍵膠原調(diào)節(jié)分子miR-29a和miR-29b）也參與了組織纖維化 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_14 o Maurer, 2010 #222 14-16。在心肌梗死過程中，人和鼠的心臟邊界miR-29a和miR-29b表達(dá)下調(diào) ADDIN EN.CITE Van Rooij20081701717017017Van Rooij

15、, E.Sutherland, L.B.Thatcher, J.E.DiMaio, J.M.Naseem, R.H.Marshall, W.S.Hill, J.A.Olson, E.N.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosisProceedings of the National Academy of SciencesProceedings of the National Academy of Sciences13027-13032105

16、3520080027-8424 HYPERLINK l _ENREF_17 o Van Rooij, 2008 #170 17。此外，miR-29作為一個主要調(diào)節(jié)分子參與了肺纖維化 ADDIN EN.CITE Cushing20112141521421417Cushing, L.Kuang, P.P.Qian, J.Shao, F.Wu, J.Little, F.Thannickal, V.J.Cardoso, W.V.L, J.miR-29 is a major regulator of genes associated with pulmonary fibrosisAmerican jou

17、rnal of respiratory cell and molecular biologyAmerican journal of respiratory cell and molecular biology2874522011 HYPERLINK l _ENREF_15 o Cushing, 2011 #223 15。最近，Roderburg等 ADDIN EN.CITE Roderburg20111721617217217Roderburg, C.Urban, G.W.Bettermann, K.Vucur, M.Zimmermann, H.Schmidt, S.Janssen, J.Ko

18、ppe, C.Knolle, P.Castoldi, M.MicroRNA profiling reveals a role for miR29 in human and murine liver fibrosisHepatologyHepatology209-21853120111527-3350 HYPERLINK l _ENREF_16 o Roderburg, 2011 #189 16在分析了CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型的miRNA調(diào)節(jié)基因芯片后，發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)及膽管結(jié)扎后大鼠的肝臟中miR-29家族中所有成員均下調(diào)；此外，在細(xì)胞水平上，在大鼠HSC中過表達(dá)miR-29b引起膠原表

19、達(dá)下調(diào)。在目前(mqin)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了在E2抑制(yzh)CCl4誘導(dǎo)(yudo)大鼠肝纖維化中的保護(hù)作用與雌雄大鼠肝臟中miR-29不同表達(dá)水平之間存在相關(guān)的特點，并發(fā)現(xiàn)在經(jīng)4周CCl4處理的雄性而非雌性小鼠的肝臟中miR-29（miR-29a和miR-29b）水平顯著下降，在雄性大鼠肝臟中miR-29a和miR-29b下調(diào)與肝纖維化加速進(jìn)展密切相關(guān)，相對于雌性大鼠，雄性大鼠的膠原、SMA和TGF-1表達(dá)增加明顯。我們的結(jié)果也表明E2提高了培養(yǎng)的大鼠肝癌細(xì)胞IAR20中miR-29a/b表達(dá)水平，同時在雌性大鼠中E2一直較雄性大鼠保持了更高水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)用E2處理和轉(zhuǎn)染表達(dá)mi

20、R-29a/b重組腺病毒提高miR-29a和miR-29b水平(Ad-miR-29a/b)顯著降低了大鼠肝臟中I型膠原和SMA表達(dá)水平，支持E2誘導(dǎo)miR-29a/b對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用。1、實驗過程1.1 動物模型 動物培養(yǎng)和實驗程序完全符合美國國家健康協(xié)會關(guān)于實驗動物使用的指導(dǎo)方針并得到南京大學(xué)醫(yī)學(xué)動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)。本研究實用8周齡雌雄性Balb/c小鼠（購自中國南京大學(xué)實驗動物中心）。50只雄性小鼠分成5組，10只/組。CCl4組：用橄欖油配成的100 mL/L CCl4腹腔注射，50l/次，2次/周 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA H

21、YPERLINK l _ENREF_1 o Domenicali, 2009 #153 1；E2組：腹腔注射，1 mg/kg，2次/周，同時使用CCl4處理，方法同上 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_5 o Liu, 2004 #158 5, HYPERLINK l _ENREF_18 o Imaoka, 2009 #173 18；Ad-對照組和Ad-miR-29a/b組：3108/U腺病毒，尾靜脈注射，2次/周，同時使用CCl4處理，方法同上 ADDIN EN.CITE Idogawa20091741917417417I

22、dogawa, M.Sasaki, Y.Suzuki, H.Mita, H.Imai, K.Shinomura, Y.Tokino, T.A single recombinant adenovirus expressing p53 and p21-targeting artificial microRNAs efficiently induces apoptosis in human cancer cellsClinical Cancer ResearchClinical Cancer Research3725-3732151120091078-0432 HYPERLINK l _ENREF_

23、19 o Idogawa, 2009 #182 19；對照組：腹腔注射橄欖油，2次/周。12只雌性小鼠分成對照組和CCl4組，6只/組，每組治療同配對雄性小鼠處理。用CCl4處理4周或8周后殺死小鼠。肝組織用4%甲醛收集固定用作組織學(xué)檢測或立即液氮冰凍和保持-80用作RNA分離。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）用ALT、AST試劑盒檢測;E2水平用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測。1.2細(xì)胞培養(yǎng)和激活(j hu) 人胚胎(piti)腎細(xì)胞293 (HEK293)和鼠肝癌(n i)細(xì)胞系IAR20購自上海細(xì)胞室。細(xì)胞用含10%新生小牛血清、100U/mL青霉素和1

24、00U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37，5恒溫CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用膠原酶灌注小鼠肝組織中分離肝細(xì)胞后培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中。IAR20細(xì)胞和分離小鼠肝細(xì)胞放在6孔板，當(dāng)細(xì)胞長至約90%時，它們培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，加入10ng/mL重組人TGF-1或100nM E2培養(yǎng)48h ADDIN EN.CITE Jiang20101752017517517Jiang, P.Xu, J.Zheng, S.Huang, J.Xiang, Q.Fu, X.Wang, T.17-estradiol down-regulates lipopolysaccharide-induced MCP-1 produc

25、tion and cell migration in vascular smooth muscle cellsJournal of molecular endocrinologyJournal of molecular endocrinology87-9745220100952-5041 HYPERLINK l _ENREF_20 o Jiang, 2010 #175 20。1.3 重組腺病毒構(gòu)建及細(xì)胞感染 表達(dá)miR-29a/b重組腺病毒由PCR檢測（如圖Fig 1）。所有miRNA前體系列擴(kuò)增引物如下：miR-29a正鏈,5GACGGTACCTGGTGGAGAACAACTTCG3;miR-

26、29a 負(fù)鏈, 5CAGAAGCTTCATCAAACCTTCAATCCC3;miR-29b正鏈,5ACCAGATCTGCGTCACGGCTC AATGTC3; miR-29b 負(fù)鏈, 5AGGCTCGAGCAGGCTTGATGGAGTCTGCT3。片段克隆入載體Ad Track-巨細(xì)胞病毒(pAdTrack-CMV) ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_21 o He, 2007 #176 21。表達(dá)miRNA的重組載體PCMV分為pCMV-miR-29a、pCMV-miR-29b、pCMV-control。插入序列均由核苷酸

27、測序證實。過程 ADDIN EN.CITE He19981772217717717He, T.C.Zhou, S.Da Costa, L.T.Yu, J.Kinzler, K.W.Vogelstein, B.A simplified system for generating recombinant adenovirusesProceedings of the National Academy of SciencesProceedings of the National Academy of Sciences2509-251495519980027-8424 HYPERLINK l _ENRE

28、F_22 o He, 1998 #177 22如下：重組載體與PmeI連接，經(jīng)電穿孔共轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合到腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1，最后導(dǎo)入大腸桿菌BJ5183。重組腺病毒質(zhì)粒由同源性重組合成；選擇陽性株并擴(kuò)增以制備DNA抽提，然后用PacI消化DNA；腺病毒質(zhì)粒(pAd-miR-29a, pAd-miR-29a,pAd-control) 與PacI連接，用酒精沉淀凈化，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)入HEK293裝入一25cm2培養(yǎng)瓶中。用20ul脂質(zhì)體2000連接4g質(zhì)粒DNA并監(jiān)測綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá) ADDIN EN.CITE Chen20061782317817817Chen, W.Liu, M.Jiao

29、, Y.Yan, W.Wei, X.Chen, J.Fei, L.Liu, Y.Zuo, X.Yang, F.Adenovirus-mediated RNA interference against foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in vivoJournal of virologyJournal of virology3559-356680720060022-538X HYPERLINK l _ENREF_23 o Chen, 2006 #178 23。在轉(zhuǎn)染12天后，收集細(xì)胞并離心10min，500g/min

30、。然后3或4個循環(huán)在干冰中冰凍和37C融化以從細(xì)胞中釋放出病毒，收集Ad-miR-29a、Ad-miR-29b、Ad-control ，然后擴(kuò)增和用腺病毒-X病毒純化試劑盒純化，實時定量PCR檢測miR-29a/b水平 ADDIN EN.CITE He19981772217717717He, T.C.Zhou, S.Da Costa, L.T.Yu, J.Kinzler, K.W.Vogelstein, B.A simplified system for generating recombinant adenovirusesProceedings of the National Academy

31、 of SciencesProceedings of the National Academy of Sciences2509-251495519980027-8424 HYPERLINK l _ENREF_22 o He, 1998 #177 22。用孔板形成實驗檢測HEK293細(xì)胞中腺病毒滴度。感染復(fù)數(shù)為總孔板形成單位與感染細(xì)胞總數(shù)比率 ADDIN EN.CITE Idogawa20091821918218217Idogawa, M.Sasaki, Y.Suzuki, H.Mita, H.Imai, K.Shinomura, Y.Tokino, T.A single recombinant

32、 adenovirus expressing p53 and p21-targeting artificial microRNAs efficiently induces apoptosis in human cancer cellsClinical Cancer ResearchClinical Cancer Research3725-3732151120091078-0432 HYPERLINK l _ENREF_19 o Idogawa, 2009 #182 19。純化病毒滴度為3.0108PFU/ml。正如附圖Fig 1描述，純化病毒成功感染細(xì)胞并表達(dá)miR-29a/b。所有病毒儲存在

33、-80C。1.4 組織病理檢查和免疫組化 形態(tài)學(xué)研究方法：肝組織保存在4%甲醛中，嵌入石蠟并切成5um厚切片。一些切片按說明書用天狼星紅染色 ADDIN EN.CITE Arias200318324, 2518318317Arias, M.Sauer-Lehnen, S.Treptau, J.Janoschek, N.Theuerkauf, I.Buettner, R.Gressner, A.M.Weiskirchen, R.Adenoviral expression of a transforming growth factor-1 antisense mRNA is effective i

34、n preventing liver fibrosis in bile-duct ligated ratsBMC gastroenterologyBMC gastroenterology293120031471-230XLpez-De Len198518418418417Lpez-De Len, A.Rojkind, M.A simple micromethod for collagen and total protein determination in formalin-fixed paraffin-embedded sectionsJournal of Histochemistry &

35、CytochemistryJournal of Histochemistry & Cytochemistry737-74333819850022-1554 HYPERLINK l _ENREF_24 o Arias, 2003 #183 24, HYPERLINK l _ENREF_25 o Lpez-De Len, 1985 #184 25。肝纖維化組織學(xué)定量評估用NIH成像軟件測天狼星紅陽性面積 ADDIN EN.CITE Berres20101852618518517Berres, M.L.Koenen, R.R.Rueland, A.Zaldivar, M.M.Heinrichs, D

36、.Sahin, H.Schmitz, P.Streetz, K.L.Berg, T.Gassler, N.Antagonism of the chemokine Ccl5 ameliorates experimental liver fibrosis in miceThe Journal of clinical investigationThe Journal of clinical investigation4129120112010 HYPERLINK l _ENREF_26 o Berres, 2010 #185 26。其他組織切片用甲苯和酒精遞減沖洗。用免疫組化檢測SMA、I型膠原、T

37、GF-1，簡單地說，就是在37C用山羊血清阻斷后，然后在4C用3種纖維化標(biāo)志物蛋白抗體培育1夜，用PBS沖洗3次，然后在37C用生物標(biāo)記的抗兔二次抗體培育30min，再用3, 3-二氨基苯胺-H2O2染色，在用蘇木精復(fù)燃，最后在光鏡下檢測。1.5 寡核苷酸和轉(zhuǎn)染 表達(dá)小鼠NF-B基因轉(zhuǎn)錄激活的pBD-NF-B購自試劑盒?？筰B或NF-B p65的siRNA單核苷酸鏈購自基因制藥生物技術(shù)公司。轉(zhuǎn)染前24h IAR20細(xì)胞密度為1106。按說明書用脂質(zhì)體2000把iB siRNA、NF-B p65 siRNA、negative control (NC siRNA) 轉(zhuǎn)染如細(xì)胞。不管是否有E2，用2

38、4ug pBD-NF-bhuo pCMV-control (control)/106細(xì)胞使NF-B過表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后48h收集總RNA和蛋白，以用于分析iB、NF-B p65 、miR-29a/b表達(dá)。1.6 定量(dngling)實時PCR 用Trizol試劑盒從肝組織抽提總RNA（2ug），然后(rnhu)按照說明書用AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒把RNA逆轉(zhuǎn)錄成20ul cDNA。在應(yīng)用生物測序系統(tǒng)7300上用2ul cDNA樣本經(jīng)實時PCR檢測。用于SMA、I型膠原、TGF-1 mRNA定量(dngling)的正反引物序列如下：TGF-1正鏈, ATCCCGCCCACTTTCTAC;TGF-1負(fù)鏈,

39、AGTTCAAT CCGCTGCTCG;-SMA 正鏈, TCGGATACTTCACGTCAGGA;-SMA負(fù)鏈,GTCCCAGACATCGGGAGTAA;Col1a1正鏈,GCTCCTCTTAGGGGCCACT; Col1a1 負(fù)鏈, CCACGTCTCACCATTGGGG; -actin正鏈, GAGACCTTCAACACCCCAGC; -actin 負(fù)鏈, ATGTCACGCACGATTTCCC。反應(yīng)條件：95C 5 min 95C 15s, 58C 30s, 72C for 30s， 40 循環(huán)。熔點曲線分析是90C (TGF-1), 85C (-SMA and Col1a1) or

40、88C (-actin)。在用-actin標(biāo)準(zhǔn)化后，每個樣本重復(fù)三次數(shù)據(jù)的平均值作為計算基因表達(dá)變化 ADDIN EN.CITE Eagon199122727, 2822722717Eagon, P.K.Francavilla, A.DiLeo, A.Elm, M.S.Gennari, L.Mazzaferro, V.Colella, G.Van Thiel, D.H.Starzl, T.E.Quantitation of estrogen and androgen receptors in hepatocellular carcinoma and adjacent normal human

41、liverDigestive diseases and sciencesDigestive diseases and sciences1303-130836919910163-2116Villa199522822822817Villa, E.Camellini, L.Dugani, A.Zucchi, F.Grottola, A.Merighi, A.Buttafoco, P.Losi, L.Manenti, F.Variant estrogen receptor messenger RNA species detected in human primary hepatocellular ca

42、rcinomaCancer researchCancer research498-50055319950008-5472 HYPERLINK l _ENREF_27 o Eagon, 1991 #227 27, HYPERLINK l _ENREF_28 o Villa, 1995 #228 28。miRNAs 和U6 snRNA引物序列如下：mmu-miR-29a, UAGCA CCAUCUGAAAUCGGUUA; mmu-miR-29b, UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU; U6 snRNA, TGCTAATCTTCTCTGTATCGT。U6 snRNA定量作為內(nèi)對照。1.7

43、 蛋白免疫雜交印跡法Western 用免疫印跡法檢測細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抽提物 ADDIN EN.CITE Villa19881872918718717Villa, E.Baldini, G. M.Pasquinelli, C.Melegari, M.Cariani, E.Di Chirico, G.Manenti, F.Chair of Gastroenterology, University of Modena, Italy.Risk factors for hepatocellular carcinoma in Italy. Male sex, hepatitis B virus, non-A

44、 non-B infection, and alcoholCancerCancerCancerCancer611-56231988/08/01*Alcohol DrinkingCarcinoma, Hepatocellular/*etiologyFemaleHepatitis B/complicationsHepatitis B Surface Antigens/*analysisHepatitis C/*complicationsHepatitis, Viral, Human/*complicationsHumansItalyLiver Cirrhosis/complicationsLive

45、r Neoplasms/*etiologyMaleRisk FactorsSex Factors1988Aug 10008-543X (Print)0008-543X (Linking)2839286Research Support, Non-U.S. Gov't/pubmed/2839286eng HYPERLINK l _ENREF_29 o Villa, 1988 #187 29。簡單地說，細(xì)胞溶解物在冷放射免疫沉淀緩沖液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% sodium dodecyl sulfate, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, p

46、rotease inhibitors, 1% Nonidet P-40, pH 8.0)擴(kuò)增，然后在10000g /min離心5min。收集上清液用于細(xì)胞質(zhì)抽提，細(xì)胞核漂浮于30ul高滲抽提緩沖液，16000g/min離心10min，上清液用于細(xì)胞核抽提。用微BCA蛋白測定試劑盒檢測細(xì)胞質(zhì)和核溶解物中蛋白量。蛋白（40ug）在10%丙烯酰胺凝膠分離并電轉(zhuǎn)移至氟乙稀膜。然后在TBST (TBS plus 0.1% Tween-20)中用5%非脂干奶封閉1h。用原始抗iB、 NF-B p65、histone H1 或 GAPDH抗體檢測，然后用HRP共軛二次抗體檢測。1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 定量RT-

47、PCR重復(fù)三次，整個實驗重復(fù)數(shù)次。三個或以上實驗數(shù)據(jù)用means SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值0.05 (*)和0.01 (*)有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 CCl4誘導(dǎo)肝損傷雌雄大鼠情況和miRNA-29表達(dá)不同 為了比較CCl4誘導(dǎo)雌雄小鼠肝纖維化情況，本實驗用50ul CCl4 (100 ml/L 橄欖油) 腹腔內(nèi)注射到雌雄Balb/c小鼠，2次/w。如Figures 1A、1B所述，在CCl4處理4周后，大部分雄性小鼠均出現(xiàn)明顯肝纖維化損害，膠原纖維明顯上調(diào)(Fig. 1A, arrow)。相反，雌鼠未出現(xiàn)明顯損害。下一步我們檢測了CCl4處理組和橄欖油對照組小鼠SMA (F

48、ig. 1C)、I型膠原(Fig. 1D)、TGF-1(Fig. 1E)水平。與組織染色結(jié)果一致，結(jié)果表明肝纖維化只出現(xiàn)在雄性而非雌性小鼠，我們發(fā)現(xiàn)TGF-1在雌雄小鼠肝組織中均上調(diào)，SMA、I型膠原上調(diào)進(jìn)出現(xiàn)在雄性而非雌雄小鼠。有趣的是，qRT-PCR檢測小鼠肝組織中miRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-29a和miRNA-29b,據(jù)報道 ADDIN EN.CITE Roderburg201118914, 1618918917Roderburg, C.Urban, G.W.Bettermann, K.Vucur, M.Zimmermann, H.Schmidt, S.Janssen, J.Ko

49、ppe, C.Knolle, P.Castoldi, M.MicroRNA profiling reveals a role for miR29 in human and murine liver fibrosisHepatologyHepatology209-21853120111527-3350Maurer201018818818817Maurer, B.Stanczyk, J.Jngel, A.Akhmetshina, A.Trenkmann, M.Brock, M.KowalBielecka, O.Gay, R.E.Michel, B.A.Distler, J.H.W.MicroRNA

50、29, a key regulator of collagen expression in systemic sclerosisArthritis & RheumatismArthritis & Rheumatism1733-174362620101529-0131 HYPERLINK l _ENREF_14 o Maurer, 2010 #222 14, HYPERLINK l _ENREF_16 o Roderburg, 2011 #189 16其靶基因為I型膠原，在CCl4處理4周后的雄性而非雌性小鼠肝組織中明顯下調(diào)(Fig. 1, F and G)。以上結(jié)果表明CCl4誘導(dǎo)雌雄小鼠肝損

51、傷后miRNA-29表達(dá)水平不同。Fig1. CCl4誘導(dǎo)肝損傷雌雄大鼠反應(yīng)和miRNA-29不同(b tn)表達(dá)。A、 B：組織(zzh)染色提示在CCl4處理的雄性而非雌性(c xn)小鼠的早期階段呈現(xiàn)肝纖維化；C-E：CCl4處理組和橄欖油對照組小鼠SMA (C)、I型膠原(D)、TGF-1(E)mRNA水平；F-G：CCl4處理組和橄欖油對照組小鼠miRNA-29a（F）和miRNA-29b(G)表達(dá)改變情況。三個實驗數(shù)據(jù)用means SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值0.05 (*)和0.01 (*)有統(tǒng)計學(xué)意義。2.2 E2處理的鼠肝癌細(xì)胞中miRNA-29表達(dá)上調(diào) 在CCl4

52、處理4周后小鼠肝功能顯示雌雄性小鼠對CCl4處理反應(yīng)不同。如表1所述，相對于單用橄欖油組，CCl4處理雄性小鼠顯示血清ALT、AST水平明顯提高，分別為31.3 6.90 IU/L、32.3 2.07 IU/L, 208.76 20.6 IU/L、207.9 23.3 IU/L。相反，相對于單用橄欖油組，盡管CCl4處理雌性小鼠血清ALT、AST水平也增高，但明顯低于雄性大鼠水平。亦如所期望的，檢測E2水平顯示雌性小鼠E2水平顯著高于雄性，不計是否用CCl4或橄欖油處理(CCl4處理組小鼠雌性：雄性為149.5 23.7 pg/ml：40.1 3.40 pg/ml; 橄欖油組小鼠雌性：雄性為1

53、32.2 12.3 pg/ml：40.5 7.65 pg/ml)。表1.在有否CCl4處理雌雄性小鼠早期階段(jidun)（4w）肝損害不同情況實驗(shyn)數(shù)據(jù)用means SEM表示(biosh)。P值0.05 (*)和0.01 (*)有統(tǒng)計學(xué)意義。 尤其在CCl4處理階段雌性小鼠高水平E2與miRNA-29a/b相關(guān)性提示E2參與miRNA-29a/b表達(dá)。以前研究顯示一些miRNA（如miR-181a、miR-26a）與E2有關(guān) ADDIN EN.CITE Maillot20091903019019017Maillot, G.Lacroix-Triki, M.Pierredon, S

54、.Gratadou, L.Schmidt, S.Bns, V.Roch, H.Dalenc, F.Auboeuf, D.Millevoi, S.Widespread estrogen-dependent repression of micrornas involved in breast tumor cell growthCancer researchCancer research8332-8340692120090008-5472 HYPERLINK l _ENREF_30 o Maillot, 2009 #226 30。相應(yīng)地，我們檢測了E2是否調(diào)控miRNA-29。本實驗，我們用E2或者

55、TGF-1刺激鼠肝癌細(xì)胞IAR20。TGF-1作為陰性對照組，顯示可以減少miRNA-29水平下降 ADDIN EN.CITE Roderburg20111911619119117Roderburg, C.Urban, G.W.Bettermann, K.Vucur, M.Zimmermann, H.Schmidt, S.Janssen, J.Koppe, C.Knolle, P.Castoldi, M.MicroRNA profiling reveals a role for miR29 in human and murine liver fibrosisHepatologyHepatolo

56、gy209-21853120111527-3350 HYPERLINK l _ENREF_16 o Roderburg, 2011 #189 16。Fig.2A示相對于對照組，E2處理組提高增加miRNA-29a和miRNA-29b水平(倍數(shù)分別是20 和10, p 0.01)。與之前研究相似，我們也觀察發(fā)現(xiàn)TGF-1明顯降低小鼠肝細(xì)胞的miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2B)。我們進(jìn)一步研究E2和TGF-1調(diào)節(jié)原代培養(yǎng)正常鼠肝細(xì)胞miR-29作用(Fig. 2, C and D)。結(jié)果顯示在正常鼠肝細(xì)胞中E2明顯提高miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2C)，而TG

57、F-1下調(diào)miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2D)。Fig2.小鼠肝癌(n i)細(xì)胞IAR20 (A 、B) 和原代培養(yǎng)(piyng)正常鼠肝細(xì)胞(C、D)受E2和TGF-1刺激(cj)后miR-29a 和miR-29b表達(dá)水平變化情況。A、C：E2刺激IAR20(A)和原代培養(yǎng)正常鼠肝細(xì)胞(C)后miR-29a 和miR-29b表達(dá)水平增高；B、D：TGF-1刺激IAR20(B)和原代培養(yǎng)正常鼠肝細(xì)胞(D)后miR-29a 和miR-29b表達(dá)水平下降。三個實驗數(shù)據(jù)用means SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值0.05 (*)和0.01 (*)有統(tǒng)計學(xué)意義。2.3 E2通

58、過阻斷NF-B通路提高肝內(nèi)miR-29a/b表達(dá)水平 E2在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起著廣泛的作用。已知與E2調(diào)控有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如NF-B、STAT-1 ADDIN EN.CITE Dai200919231, 3219219217Dai, R.Phillips, R.A.Karpuzoglu, E.Khan, D.Ahmed, S.A.Estrogen regulates transcription factors STAT-1 and NF-B to promote inducible nitric oxide synthase and inflammatory responsesThe Journa

59、l of ImmunologyThe Journal of Immunology6998-70051831120090022-1767Murphy201019419419417Murphy, A.J.Guyre, P.M.Pioli, P.A.Estradiol suppresses NF-B activation through coordinated regulation of let-7a and miR-125b in primary human macrophagesThe Journal of ImmunologyThe Journal of Immunology5029-5037

60、184920100022-1767 HYPERLINK l _ENREF_31 o Dai, 2009 #192 31, HYPERLINK l _ENREF_32 o Murphy, 2010 #194 32。有趣的是，之前研究也報道NF-B可以負(fù)性調(diào)控miR-29a 和miR-29b表達(dá) ADDIN EN.CITE Mott20101953319519517Mott, J.L.Kurita, S.Cazanave, S.C.Bronk, S.F.Werneburg, N.W.FernandezZapico, M.E.Transcriptional suppression of mir29b