1、一種分離培養(yǎng)及鑒定小鼠牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的方法陳麗玲徐振健徐安平【摘要】目的探討建立一種新型、簡(jiǎn)便易行的小鼠牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞 （GMSC）體外提取及培養(yǎng)方法。方法選擇C57BL/6小鼠，使用IV型膠 原酶消化分離其牙齦組織，種板培養(yǎng)并傳代。利用細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒 性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）觀察小鼠GMSC的增殖規(guī)律，流式細(xì)胞術(shù) 檢測(cè)小鼠GMSC的細(xì)胞表面標(biāo)志物，進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)， 觀察所提取GMSC的多向分化潛能。結(jié)果CCK-8試驗(yàn)顯示小鼠GMSC在 培養(yǎng)第34日增殖活躍（第25日相鄰時(shí)間點(diǎn)間，P均0.05）,第 5日開始增殖進(jìn)入平臺(tái)期（第58日的相鄰時(shí)間點(diǎn)間比較,P均0. 05）。

2、流式余田胞術(shù)結(jié)果顯示，與小鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞相比，GMSC高表達(dá) CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105 （P 均 0.05）,幾乎不表達(dá) CD34、 CD45 （P均0.05）；多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，GMSC成功分化為對(duì)應(yīng)的組 織細(xì)胞，證實(shí)了 GMSC的多向分化功能。結(jié)論本研究成功提取小鼠GMSC, 首次發(fā)現(xiàn)了一種新的、操作簡(jiǎn)便的、對(duì)原代細(xì)胞傷害少且有較高細(xì)胞 獲得率的科學(xué)提取GMSC方法，并鑒定了其細(xì)胞標(biāo)志物和分化功能?！娟P(guān)鍵詞】牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞;提取培養(yǎng);誘導(dǎo)分化；鑒定【AbstractObjectiveToestablishanovelandsimplemethodfor

3、isolationandcul tureofmousegingivalmesenchymalstemcells（ GMSCs ）invitro. MethodsThegingivaltissuesfromC57BL/6micewereseparat edanddigestedwithtypeIVcollagenase, culturedinadishandpassaged. TheproliferationpatternofmouseGMisandboneerosionviaCD39-adenosinesignalpathwayinautoimmunea rthritis. EBioMedic

4、ine, 2022, 43： 620-631. llWuW ,XiaoZ ,ChenY ,etal. CD39producedfromhumanGMSCsregulatesthebalanceofosteocl astsandosteoblaststhroughtheWnt/B -cateninpathwayinosteopor osis.MolTher, 2022, 28 (6)： 1518-1532.12ChenM ,SuW ,LinX ,etal. Adoptivetransferofhumangingiva-derivedmesenchymalstemc ellsameliorates

5、collagen-inducedarthritisviasuppressionofThl andThl7cellsandenhancementofregulatoryTce11differentiation. ArthritisRheum, 2022, 65 (5)： 1181-1193.13ZhangW ,ZhouL ,DangJ ,etal. Humangingiva-derivedmesenchymalstemcellsameliorateStre ptozoticin-induced?IDMinmiceviasuppressionofTeffectorcelisa ndup-regul

6、atingTregsubsets. SciRep, 2022, 7 (1)： 15249.14DangJ,XuZ,XuA,etal. Humangingiva-derivedmesenchymalstemcellsaretherapeutic inlupusnephritisthroughtargetingofCD39-CD73signalingpathway .JAutoimmun, 2022, 113： 102491. 15XuX,ChenC ,AkiyamaK ,etal. Gingivaecontainneural-crest-andmesoderm-derivedmesench ym

7、alstemcells. JDentRes, 2022, 92 (9)： 825-832.16GuY,ShiS. Transplantationofgingiva-derivedmesenchymalstemcellsam elioratescollagen-inducedarthritis. ArthritisResTher, 2022,18 (1)： 262.17WangX ,SongH ,ZhaoS ,etal. Gingival-derivedmesenchymalstemcellsprotectagainstseps isanditscomplications. InfectDrug

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11、22, 12： 667221.(收稿日期:2022-01-20)(本文編輯：林燕薇)SCswasinvest!gatedbyCellCountingKit-8( CCK-8 )assay. ThesurfacemarkersofGMSCsweredetectedbyflowcytometry , andadipogenicandosteogenicdifferentiationexperimentswerecar riedouttoexplorethemulti-directionaldifferentiationpotentia loftheextractedGMSCs. ResultsCC

12、K8assayshowedthatmouseGMSCsac tivelyproliferatedat3to4dafterculture( allPO. 05betweenanytwoconsecutivedaysfrom2ndto5thd ) , andbegantobecomesteadyonday5 TOC o 1-5 h z (allPO. 05betweenanytwoconsecutivedaysfrom5thto8thd) . Flowe ytometryshowedthatGMSCshighlyexpressedCD29 , CD44 , CD73 , CD90andCD105(

13、allPO. 05),butbasicallydidnotexpressCD34anclCD45comparedwithmouseoralmu cosalepithelialcells(bothPO. 05 ) .Muiti-directionaldifferentiationinductionexpe rimentdemonstratedthatGMSCssuccessfullydifferentiatedintoco rrespondingtissuecells,confirmingthemulti-directionaldifferentiationpotentialofGMS Cs.C

14、onelusionsInthisstudy,mouseGMSCsaresuccessfullyisolatedbyanewandsimplemethodforth efirsttime,whichcausesslightdamagetoprimarycel1sandyieldshighcellacqui sitionrate. Thecellmarkersanddifferentiationfunctionarealsoi dentified.LKeywordsJGingivalmesenchymalstemcell；Isolationandculture；Inductiondi fferen

15、tiation；Identification間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有自我更新、多能分化和免疫調(diào)節(jié)的作用。 近年研究顯示，MSC可在包括變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性鼻炎、急性青光 眼、阿爾茨海默病和1型糖尿病等多種疾病中發(fā)揮治療作用1-6。 MSC可以從不同的組織中分離出來(lái)，包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪組 織和人的牙齦7。牙齦MSC (GMSC)是一種從牙齦組織中獲得的MSC 亞群，2022年Zhang等首次從人牙齦組織中分離出GMSC,并證實(shí)了 其表型及功能活性8。與其他MSC類似，GMSC也具有抑制炎癥和調(diào) 節(jié)免疫反應(yīng)的作用。小鼠和人源化動(dòng)物模型研究顯示，GMSC能夠通 過(guò)減少效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、樹突

16、狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和增加 調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞等治療包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、SLE、動(dòng) 脈粥樣硬化等多種疾病7, 9-14 o既往文獻(xiàn)提及的小鼠GMSC的提取 方法需使用多種酶及復(fù)雜的培養(yǎng)基等15-16。本研究以C57BL/6小 鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，旨在建立更為簡(jiǎn)便、高效的GMSC體外提取及培養(yǎng)體系， 現(xiàn)報(bào)道如下。材料與方法 一、動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠5只，雌雄不限，810周齡，體質(zhì)量1520g, 購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵循減少、替代、優(yōu) 化的倫理規(guī)范操作，做到充分考慮動(dòng)物的利益，善待動(dòng)物，防止或減 少動(dòng)物的應(yīng)激、痛苦和傷害，尊重動(dòng)物生命，采取痛苦最少的方法處 置

17、動(dòng)物。二、主要試劑包括：a包括：a-MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清(FBS),均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；IV型膠原酶、地塞米松、甘油磷酸鈉、抗 壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘿吟（IBMX）、呻喋美辛、人胰島素、油 紅0染液，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 （CCK-8法）購(gòu)自美國(guó)APExBio公司；結(jié)晶紫染液、茜素紅染液，均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗小鼠流式抗體CD29、CD34、 CD44、CD45、CD73、CD90、CD105,均購(gòu)自美國(guó) BD 公司。三、培養(yǎng)液配制原代細(xì)胞培養(yǎng)液為a-MEM培養(yǎng)基+20%FBS。完全培養(yǎng)液為 a -MEM

18、+10%FBSo 成脂誘導(dǎo)液為 a -MEM 培養(yǎng)基+10%FBS+200 口 mol/L 呻噪美辛+10mg/L胰島素+1 u mol/L地塞米松+500 u mol/LIBMXo成骨 誘導(dǎo)液為 a -MEM+10%FBS+10nmol/L地塞米松+50mg/L抗壞血酸 +10mmol/L 8 -甘油磷酸鈉。四、實(shí)驗(yàn)方法.小鼠GMSC的分離培養(yǎng)處死C57BL/6小鼠，取小鼠下頜骨，清除多余皮膚及肌肉組織，用含 有5%雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗下頜骨多次。用注射器針頭輕 輕分離磨牙區(qū)牙齦。收集分離到的組織于培養(yǎng)皿中，加入Img/LW型 膠原酶，于37中消化30min,加入含有FBS的a-

19、MEM終止消化， 離心，棄上清。將組織鋪于6孔板中，每孔加1ml含20%FBS的a-MEM, 置于37C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待23d后細(xì)胞爬出，換液把剩余 組織塊洗出，每孔加2ml20%FBS的a -MEM, 3d換1次液。細(xì)胞長(zhǎng)滿 板底80%后傳代，傳代后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。.小鼠GMSC的增殖能力檢測(cè)按細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）說(shuō)明書進(jìn)行操作，連 續(xù)8d在同一時(shí)間使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度，根據(jù)結(jié)果繪制 GMSC生長(zhǎng)曲線。.小鼠GMSC的表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將第2代GMSC （約1X106個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液用PBS洗滌2次，用 10

20、0 u 1PBS重懸后分別加入流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、 CD90、CD105, 4。（3避光蜉育20min后，PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢 測(cè)上述細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。.小鼠GMSC的多向分化潛能誘導(dǎo) 成脂誘導(dǎo)分化:取第2代GMSC接種于6孔板,每孔約3義103個(gè)細(xì)胞, 待細(xì)胞鋪滿板底70%,更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，每隔3d換1次液。誘導(dǎo)21d后，PBS洗滌細(xì)胞1次，4%多聚甲醛固定30min,去離子水 洗滌2次后油紅0染液染色20min,蒸儲(chǔ)水清洗3次，干燥后倒置顯 微鏡下觀察并拍照。成骨誘導(dǎo)分化:取第2代GMSC接種于6孔板,每孔約3X 103個(gè)細(xì)胞， 待

21、細(xì)胞鋪滿板底70%,更換為成骨誘導(dǎo)液，每隔3d換1次液。誘導(dǎo) 28d后，PBS洗滌細(xì)胞1次，4%多聚甲醛固定30min,去離子水洗滌2 次后茜素紅染液染色30min,蒸偏水清洗3次，干燥后倒置顯微鏡下 觀察并拍照。五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用GraphPadPrism8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較采用單因素方差分析, 進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-1檢驗(yàn)。P0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 一、小鼠GMSC的分離培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)23d后，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可見(jiàn)原代細(xì)胞從組織爬出，貼 壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀（圖1A）?？梢?jiàn)原代細(xì)胞培養(yǎng)至1014d時(shí)細(xì) 胞鋪

22、滿皿底80% （圖IB、C）,可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。二、小鼠GMSC的增殖能力檢測(cè)結(jié)果CCK-8法結(jié)果顯示，GMSC在第34日增長(zhǎng)最快，在第58日增長(zhǎng)變 得緩慢，出現(xiàn)平臺(tái)期。普通光學(xué)倒置顯微鏡下可見(jiàn)GMSC在第34日 數(shù)量增長(zhǎng)明顯，在第58日數(shù)量逐漸到達(dá)最大值，并進(jìn)入平臺(tái)期。 各時(shí)間點(diǎn)的變化組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=339. 90, P0. 001), 其中第02日、第58日的相鄰時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均0. 05。第25日相鄰時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0. 05), 見(jiàn)圖2。三、小鼠GMSC的細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果小鼠GMSC高表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD

23、105,最高的表達(dá)率達(dá)90% 及以上，CD73最高表達(dá)率高于70%, CD39最高表達(dá)率為26. 3%,同時(shí) 結(jié)果顯示所提取細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD34、CD45,表達(dá)率均低于5%,說(shuō) 明所提取的細(xì)胞純度較高。以小鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞，可 見(jiàn) GMSC 的 CD29 (t=2. 686, P=0.036)、CD44 (t=22. 582, P0. 001). CD73(t=3. 183,P=0. 019)、CD90(t=62. 944,P0. 001)、CD105(t=8. 590, P0. 001). CD39 (t=5, 799, P0. 001)的表逵均高于對(duì)照細(xì)胞,兩者 CD34 (

24、t= 1.572, P=0.140)、CD45 (t=-1.643, P=0. 151)表達(dá)相似， 見(jiàn)圖3O四、小鼠GMSC的成脂言秀導(dǎo)及鑒定結(jié)果小鼠GMSC經(jīng)成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后，分化為脂肪細(xì)胞并分泌出脂滴， 經(jīng)油紅0染液染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)葡萄串狀紅色脂滴形成, 見(jiàn)圖4。五、小鼠GMSC的成骨誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果小鼠GMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，細(xì)胞逐漸從長(zhǎng)紡錘形變?yōu)槎噙呅危?并呈多層覆蓋生長(zhǎng)，可見(jiàn)陸續(xù)出現(xiàn)小的鈣化。成骨誘導(dǎo)28d后，小鼠GMSC經(jīng)茜素紅染液染色后可見(jiàn)紅褐色鈣化結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖5。討論近年來(lái)，GMSC在自身免疫性和炎癥性疾病中的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用 越來(lái)越受到重視17。與其他組織來(lái)

25、源的MSC相比，GMSC具有易于 分離、便于獲取、增殖快、不具致瘤性、同源性好、免疫調(diào)節(jié)作用及 再生功能強(qiáng)于其他MSC等優(yōu)點(diǎn)18-20 o目前，小鼠等動(dòng)物GMSC的提取方法為組織消化法或組織塊法：組織 消化法使用膠原酶和分離酶消化分離的組織塊，再通過(guò)過(guò)濾器獲得單 細(xì)胞懸液進(jìn)行種板，操作步驟繁雜，且多種酶的消化易對(duì)原代GMSC 造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞提前分化失去其生物學(xué)特性;組織塊法則將沖洗 無(wú)菌的組織塊直接種板，通過(guò)倒立培養(yǎng)瓶的方法獲取原代細(xì)胞，該法 提取細(xì)胞數(shù)量少、效率低且成功率不穩(wěn)定15。本研究將2種提取原代GMSC的方法相結(jié)合并加以改良，對(duì)分離的牙 齦組織僅用IV型膠原酶消化半小時(shí)，然后把消

26、化后的牙齦組織直接種 板，23d后可見(jiàn)細(xì)胞爬出。由此可見(jiàn)該改良方法具有以下優(yōu)點(diǎn)： 步驟過(guò)程簡(jiǎn)單、易操作;僅用一種消化酶，減短了消化時(shí)間，不僅 減少了消化酶對(duì)原代細(xì)胞的損傷，而且節(jié)約了試劑成本;經(jīng)膠原酶 處理的牙齦組織變軟后再進(jìn)行種板，更有利于種板后GMSC從組織中 爬出，短時(shí)間內(nèi)有較高的細(xì)胞獲得率，節(jié)約時(shí)間成本，同時(shí)通過(guò)換液、 傳代可進(jìn)一步純化細(xì)胞;培養(yǎng)液成分更為簡(jiǎn)單。與組織消化法及組 織塊法相比，新的提取GMSC方法更為簡(jiǎn)便、易行，見(jiàn)表1。本研究中小鼠GMSC生長(zhǎng)曲線從一定程度上可反映GMSC的增殖規(guī)律, 第34日增殖活躍，第5日始增殖進(jìn)入平臺(tái)期，第78日由于培養(yǎng) 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，細(xì)胞

27、開始出現(xiàn)凋亡，數(shù)量有少許下降。本研 究所提取的細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105,最高表達(dá)率均高 于90%, CD73最高表達(dá)率高于70%,基本不表達(dá)造血細(xì)胞的細(xì)胞表面 標(biāo)志物CD34、CD45,最高表達(dá)率均低于5%,符合GMSC細(xì)胞標(biāo)志物特 性，同時(shí)提示所取取的細(xì)胞純度較高。多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，小鼠 GMSC在各自特定誘導(dǎo)條件下成功分化成對(duì)應(yīng)組織，證實(shí)了 GMSC的多 向分化功能。本研究表明，改良法提取的GMSC具有快速增殖的優(yōu)點(diǎn)， 同時(shí)通過(guò)該法所分離的細(xì)胞有較高的純度，且能表現(xiàn)多向分化的干細(xì) 胞特性，因此該法提取GMSC是可行的。對(duì)GMSC的相關(guān)研究表明，GMSC在倫理學(xué)、

28、獲取方法和分化潛能等方 面具有明顯優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種較好的MSC來(lái)源，在細(xì)胞治療、再生 醫(yī)學(xué)等方面具有重要的研究意義21-22 o本研究的動(dòng)物GMSC提取技 術(shù)的研究與改良有助于促進(jìn)各類疾病動(dòng)物模型GMSC的自體移植的實(shí) 現(xiàn)，有利于深入研究GMSC對(duì)疾病治療作用的可能機(jī)制。參考文獻(xiàn),1SuW ,WanQ ,HuangJ ,etaL Cu11uremediumfromTNF-a -stimulatedmesenchymalstemcells attenuatesallergicconjunctivitisthroughmultipleantiallergic mechanisms. JAller

29、gyClinlmmunol, 2022, 136 (2)： 423432.e8. 2FanXL ,ZengQX ,LiX ,etal. Inducedpluripotentstemcell-derivedmesenchymalstemcells activatequiescentTce11sandelevateregulatoryTcellresponsevia NF-k Binallergicrhinitispatients. StemCellResTher,2022,9(1)： 170.3SuW,LiZ,JiaY,etal. microRNA-21a-5p/PDCD4axisregulatesmesenchymalstenicell- inducedneuroprotectioninacuteglaucoma. JMolCellBiol, 2022, 9(4)： 289-301.4ShinJY , ParkHJ , Ki