1、實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌染色體DNA的提取和檢測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握提取細(xì)菌核酸的方法；理解DNA電泳的基本原理和各種影響因素；學(xué)習(xí)制膠、水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理核酸存在于多種細(xì)胞，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、動(dòng)植物細(xì)胞、血液、組織、唾液、尿液等多種標(biāo)本中，其分離方法是多樣的。總的來說核酸的分離與純化是在溶解細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用苯酚等有機(jī)溶劑抽提，分離，純化；乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑沉淀，收集。本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌染色體DNA的提取主要是用溶菌酶、SDS和蛋白酶K處理細(xì)菌，將蛋白質(zhì)變性使其與DNA分離。電泳是指混懸于溶液中的電荷顆粒,在電場影響下向著與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。DNA電泳

2、是基因工程中最基本的技術(shù)，DNA制備及濃度測定、目的DNA片斷的分離，重組了的酶切鑒定等均需要電泳完成。根據(jù)分離的DNA大小及類型的不同，DNA電泳主要分兩類：一是聚丙烯酰胺凝膠電泳：適合分離1kb以下的片斷，最高分辨率可達(dá)1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此凝膠進(jìn)行純化，也稱PAGE純化。二是瓊脂糖凝膠電泳：可分離的DNA片斷大小因膠濃度的不同而異。電泳結(jié)果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級(jí)，而且整個(gè)過程一般1h即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中經(jīng)常使用。三、實(shí)驗(yàn)材料和儀器1、實(shí)驗(yàn)材料：某細(xì)菌2、實(shí)驗(yàn)儀器:1.5mL離

3、心管；槍頭；移液器；搖床；臺(tái)式高速離心機(jī)；電泳槽；電泳儀；微波爐；電泳板和梳子；紫外分析儀；數(shù)碼相機(jī)等四、實(shí)驗(yàn)試劑（一）：1、TE緩沖液（10：1）：10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA,pH 8.0。本次試驗(yàn)略去。2、裂解緩沖液（1mL體系：40mmol/L Tris-HCl，pH8.0，40ul；2mmol/L CH3COONa，6.6ul；1mmol/L EDTA，2ul；10%SDS，1ul；其余用水補(bǔ)齊）（現(xiàn)用現(xiàn)配，老師處）3、溶菌酶：100g/mL（已配好，老師處）4、Proteinase K：10mg/mL （已配好，老師處）5、10%SDS（已配好，老

4、師處）6、NaCl：5mol/L7、Tris飽和苯酚（老師處加樣）8、三氯甲烷（老師處加樣）9、無水乙醇、70%乙醇（已配好，老師處）（二）：1、50*TAE電泳緩沖液：242.0gTris堿；100mL0.5mol.L-1/EDTA(pH8.0)；57.1mL冰醋酸。定容1L。（老師已配好）2、EB母液（溴化乙錠，儲(chǔ)存液用水配制為1mg.mL-1）：稱取一定量的EB溶于無菌水中，室溫閉光保存；EB為強(qiáng)誘變劑，實(shí)驗(yàn)中要防止污染。（老師已配好）3、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量:購買商品4、10*Loading buffer(pH 7.0)：購買商品（包含：EDTA 50mmol.L-1 ；甘油 60；Xy

5、lene Cyanol FF(W/V) 0.25；Bromophenol Blue(W/V) 0.25）5、瓊脂糖五、實(shí)驗(yàn)步驟（一）DNA的提取（1）菌體培養(yǎng)：將此菌接種于普通液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)18h，獲得足夠菌體。（由老師完成）（2）菌體收集：取1 mL培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，12000r/min離心5min，棄上清，收集菌體（注意吸干多余水分）。重復(fù)一次。（3）向每管加入200L裂解緩沖液，用吸管頭緩慢抽吸，懸浮和裂解細(xì)胞，再加入50L，100g/mL溶菌酶（-20度保存），緩慢抽吸，37處理30min。（4）加入10L，10mg/mL蛋白酶K，緩慢抽吸，37處理30min。（

6、5）加入66L，5mol/L NaCl溶液，充分混勻后，12000r/min，10min。除去蛋白質(zhì)復(fù)合物及細(xì)胞壁等殘?jiān)?。?）將上清轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積Tris飽和苯酚，充分混勻后，12000r/min，5min，進(jìn)一步沉淀蛋白。（7）取離心后水層，加等體積氯仿，充分混勻，12000r/min，5min，（除苯酚。）（8）取上清，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀，30min以上（時(shí)間越長越好）。之后15000r/min高速離心15min，棄上清。（9）用200L 70%乙醇洗滌2次，12000r/min，2min，棄上清。（10）干燥后，20-50L超純水溶解DNA，-20放置備用。（二）電泳檢測1、用1*TAE電泳緩沖液按照被分離DNA分子的大小配制一定濃度（1.0）的瓊脂糖凝膠30-50mL，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。(電爐，小膠是25mL)2、用透明膠封固玻璃板兩頭，在距底板0.51.0mm的位置上放置梳子，將溫?zé)幔ɡ鋮s至50左右）的瓊脂糖凝膠倒入膠模中，凝膠厚度在35mm之間。3、在凝膠完全凝固后，撕去透明膠，小心將玻璃板移至裝有1*TAE緩沖液的電泳槽中，輕輕的拔去梳子，且使緩沖液沒過膠面約1mm。4、DNA樣品與10*Loading buffer（含有溴酚藍(lán)和甘油等物質(zhì)）混合后，用微量取樣器慢慢將混合