1、實(shí)驗(yàn)(shyn)一、光學(xué)顯微鏡構(gòu)造和使用 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)則：保持實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的整潔；保持安靜有序的實(shí)驗(yàn)秩序；規(guī)范操作，愛護(hù)儀器設(shè)備；不隨意動(dòng)用不必要的儀器設(shè)備，更不可在不懂操作規(guī)程的情況下或不按規(guī)范使用儀器設(shè)備；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后認(rèn)真、完整地填寫“儀器設(shè)備使用記錄”，儀器運(yùn)行出現(xiàn)異?；驌p壞要及時(shí)報(bào)告老師，不可私自拆裝儀器；鼓勵(lì)提出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或操作的改進(jìn)(gijn)意見；獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。共四十六頁(yè)本學(xué)期細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)開設(shè)(kish)項(xiàng)目和時(shí)間安排序號(hào)項(xiàng)目名稱學(xué)時(shí)性質(zhì)01顯微技術(shù)總論（光學(xué)顯微鏡構(gòu)造及使用）6綜合性02葉綠體的提取分離和熒光觀察3綜合性03細(xì)胞器的超活染色技術(shù)3驗(yàn)證性04哺乳類紅細(xì)胞

2、綜合實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞凝集和低滲溶血）3驗(yàn)證性05巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象觀察3驗(yàn)證性06植物染色體標(biāo)本制作和組型分析6綜合性07動(dòng)物染色體標(biāo)本制作技術(shù)3綜合性08動(dòng)物細(xì)胞微絲束的光學(xué)顯微觀察6綜合性09染色體核仁組織區(qū)的銀染色法3驗(yàn)證性10雞紅細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)3驗(yàn)證性11生物制片技術(shù)6綜合性共四十六頁(yè) 光學(xué)顯微鏡構(gòu)造(guzo)和使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解和掌握普通(ptng)光鏡、暗視場(chǎng)顯微鏡、相差、熒光、微分干涉差、倒置等顯微鏡的原理和使用方法。同時(shí)簡(jiǎn)單介紹電鏡原理。2 了解掌握光學(xué)顯微鏡的光路合軸方法，了解顯微攝影的基本操作。共四十六頁(yè)二、原理(yunl)和方法一）普通（明場(chǎng)）光學(xué)顯微鏡1 普通明場(chǎng)光學(xué)顯微

3、鏡各零部件構(gòu)成：鏡座、柱、筒、臂、轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、調(diào)節(jié)器、光源及光源聚光鏡，視場(chǎng)光闌、孔徑光闌、鏡臺(tái)下聚光器、聚光器前透鏡、物鏡和目鏡。2 物鏡的種類：消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡、平場(chǎng)物鏡。3 顯微鏡的光路原理(yunl)（略）光源色光視場(chǎng)光闌折射孔徑光闌聚光鏡樣品在物鏡后焦平面成像目鏡觀察共四十六頁(yè)4 顯微(xin wi)性能參數(shù)顯微鏡的性能參數(shù)包括分辨率、放大率，焦點(diǎn)深度、視場(chǎng)寬度等。1）分辨率：R=0.61 /N.A.； N.A.sin/2式中：n=介質(zhì)折射率；=孔徑角（鏡口角，物鏡最邊緣斜光線與顯微鏡光軸所成的交角(jio jio)），N.A.=數(shù)值孔徑（鏡口率，numeric aper

4、ture）。鏡口角總是要小于180，所以sina/2的最大值必然小于1。2）顯微鏡總放大率（Mt）=物鏡放大率目鏡放大率攝影透鏡放大率；有效放大率 = 物鏡數(shù)值孔徑的500-1000倍，故需根據(jù)物鏡選配適宜的目鏡。共四十六頁(yè)5 顯微鏡的使用(shyng)1）光路合軸：鏡檢與攝影前，使照明光線與顯微鏡光軸合一即為光路合軸，整個(gè)過(guò)程涉及到聚光器調(diào)中和光源燈絲調(diào)中兩部分，詳細(xì)過(guò)程參閱教材。2）光闌的調(diào)節(jié)：視場(chǎng)光闌用于控制照明光束可以限定視場(chǎng)大??；孔徑光闌用于限定聚光器孔徑大小。調(diào)節(jié)時(shí)以視場(chǎng)光闌內(nèi)緣外切孔徑光闌為基準(zhǔn)。3）各種特殊光學(xué)構(gòu)件的安裝、調(diào)試和使用(shyng)（以BX-50系統(tǒng)顯微鏡為例）共

5、四十六頁(yè)OLYMPUS BX 50系統(tǒng)(xtng)顯微鏡組成部分共四十六頁(yè)OLYMPUSBX 50共四十六頁(yè)共四十六頁(yè)光強(qiáng)預(yù)置(y zh)旋鈕粗細(xì)(cx)準(zhǔn)焦旋鈕共四十六頁(yè)激發(fā)(jf)模塊共四十六頁(yè)萬(wàn)能(wnnng)聚光鏡孔徑(kngjng)光欄拉桿共四十六頁(yè)萬(wàn)能(wnnng)聚光鏡視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)(tioji)環(huán)共四十六頁(yè)光路合軸調(diào)中 轉(zhuǎn)動(dòng)聚光鏡高度升降旋鈕把聚光鏡升高到最高位置； 放入樣品，將DIC、起偏器等光學(xué)附件移出光路，聚光鏡轉(zhuǎn)到明場(chǎng)上； 用4X或10X物鏡聚焦，調(diào)至清晰； 視場(chǎng)光闌打至最??； 通過(guò)調(diào)節(jié)聚光鏡升降旋鈕下降聚光鏡，使視場(chǎng)中出現(xiàn)清晰正多邊形圖像； 通過(guò)調(diào)節(jié)聚光鏡中心調(diào)節(jié)旋鈕，

6、把正多邊形圖像移至視場(chǎng)中心位置； 逐步打開視場(chǎng)光闌，如正多邊形與視場(chǎng)邊緣內(nèi)切，則聚光鏡已正確對(duì)中； 實(shí)際觀察中，稍加大視場(chǎng)光闌，使它的圖象剛好(gngho)與視場(chǎng)外切即可。共四十六頁(yè)光路合軸調(diào)中過(guò)程(guchng)共四十六頁(yè)調(diào)節(jié)(tioji)裝置共四十六頁(yè)二）暗視野顯微鏡特殊部件：暗視野聚光器/暗視野光擋1 由于聚光器構(gòu)造的特殊性，導(dǎo)致直射光線不能進(jìn)入視野，此時(shí)(c sh)視野黑暗。光線斜向照射時(shí)，樣品產(chǎn)生散射光，一部分散射光線可以進(jìn)入視野，在黑暗視野中樣品邊緣明亮。2 暗視野光檔：光擋直徑取決于物鏡數(shù)值孔徑，光擋恰好能擋住物鏡通光孔徑。另一個(gè)問(wèn)題是暗視場(chǎng)聚光器的調(diào)中。共四十六頁(yè)暗視野光擋共四

7、十六頁(yè)暗視野顯微鏡調(diào)節(jié)(tioji)使用開啟照明光源明場(chǎng)（BF）聚焦轉(zhuǎn)動(dòng)(zhun dng)萬(wàn)能聚光鏡轉(zhuǎn)盤至DFA起偏器拉出光路檢偏器拉出光路調(diào)節(jié)孔徑光欄至可見樣品調(diào)節(jié)載物臺(tái)使樣品聚焦取下目鏡，觀察物鏡外緣，調(diào)節(jié)并對(duì)中暗場(chǎng)環(huán)裝置；裝好目鏡觀察暗場(chǎng)圖像，重復(fù)對(duì)中直至獲得光學(xué)暗場(chǎng)效果圖像上下移動(dòng)聚光鏡直到獲得均勻的暗場(chǎng)照明將視場(chǎng)光闌開大到獲得均勻亮度的程度共四十六頁(yè)三）倒置(dozh)顯微鏡光源(gungyun)在上，物鏡在下，光路設(shè)計(jì)與普通顯微鏡正好相反，經(jīng)常用于觀察工作距離較大的樣品，如觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。共四十六頁(yè)四）相差(xin ch)顯微鏡部件構(gòu)成：環(huán)狀光闌，相差物鏡1這種顯微鏡最大的特點(diǎn)

8、是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。光線經(jīng)環(huán)狀光闌投射樣品的直射光和衍射光透過(guò)物鏡相差板時(shí)，把透過(guò)標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高(t go)了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了1/4（波長(zhǎng)），如果再增加或減少1/4，則光程差變?yōu)?/2，兩束光合軸后相互干涉加強(qiáng)，振幅增大或減小，提高(t go)反差，造成不同的反差效果。2 聚光器調(diào)中，需要借助調(diào)中望遠(yuǎn)鏡調(diào)中。 共四十六頁(yè)相差(xin ch)物鏡共四十六頁(yè)對(duì)中望遠(yuǎn)鏡共四十六頁(yè)相差顯微鏡調(diào)節(jié)(tioji)使用開啟照明光源明場(chǎng)（BF）聚焦轉(zhuǎn)動(dòng)萬(wàn)能聚光鏡轉(zhuǎn)盤至Ph（X），使匹配的環(huán)

9、狀光闌進(jìn)入光路選擇與聚光鏡相匹配的同型物鏡Ph（X）起偏器拉出光路檢偏器拉出光路打開孔徑光闌（孔徑光闌太小中央可能產(chǎn)生眩光）對(duì)樣品聚焦，取下目鏡（可換上調(diào)中望遠(yuǎn)鏡,CT），調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌對(duì)中螺絲，使亮環(huán)和暗環(huán)在視場(chǎng)內(nèi)重疊，（更換不同倍率物鏡需重復(fù)調(diào)節(jié)）取下對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，換上目鏡觀察(gunch)（可插入綠色干涉濾色片，以增大反差）。共四十六頁(yè)五）偏光(pin un)顯微鏡部件構(gòu)成：起偏器+檢偏器偏光顯微鏡用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有起偏器，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器。檢偏器偏振方向與起偏器垂直時(shí)則為正交偏光鏡，這種

10、顯微鏡的載物臺(tái)一般是可以旋轉(zhuǎn)的，當(dāng)載物臺(tái)上放入單折射的物質(zhì)時(shí)，無(wú)論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過(guò)(tnggu)這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測(cè)到這種物體。共四十六頁(yè)共四十六頁(yè)簡(jiǎn)易(jiny)偏光顯微鏡調(diào)節(jié)使用開啟照明光源明場(chǎng)（BF）聚焦起偏器推入光路檢偏器（U-ANT）推入光路調(diào)節(jié)起偏器旋轉(zhuǎn)(xunzhun)旋鈕以獲得暗場(chǎng)（正交尼科爾位置）并固緊旋鈕調(diào)節(jié)孔徑光欄與光照強(qiáng)度至最佳效果（關(guān)小孔徑光闌可增大圖像反差）共四十六頁(yè)起偏器拔出(b ch)狀態(tài)視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)(tioji)環(huán)共四十六頁(yè)檢偏器拔出(b ch)狀態(tài)共四十六頁(yè)六

11、）微分(wi fn)干涉差顯微鏡部件構(gòu)成：起偏器+DIC棱鏡+DIC滑行器+檢偏器偏振器裝在聚光器的前面，使光線發(fā)生線性偏振，聚光器前的DIC棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過(guò)標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，兩束光產(chǎn)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)DIC棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合并成一束。這時(shí)兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿過(guò)第二個(gè)偏振裝置，即檢偏器，檢偏器與起偏器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉

12、。于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出亮暗差，成像效果有浮雕立體感。為了使影像的反差達(dá)到最佳狀態(tài)，可通過(guò)調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來(lái)改變光程差，改變影像的亮度(lingd)，使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，三維立體感明顯。共四十六頁(yè)微分干涉差顯微鏡調(diào)節(jié)(tioji)使用開啟照明光源(gungyun)明場(chǎng)（BF）聚焦起偏器推入光路DIC滑座（附檢偏器）推入光路，固緊螺絲順時(shí)針把DIC棱鏡控制鈕旋轉(zhuǎn)到頭取下目鏡可見物鏡外緣，同時(shí)調(diào)節(jié)起偏器旋鈕至黑色條紋最黑的位置（若為兩條黑紋，起偏器旋轉(zhuǎn)90，以使只可見一條黑色條紋）固緊起偏器旋鈕；目鏡復(fù)位，轉(zhuǎn)動(dòng)萬(wàn)能聚光鏡轉(zhuǎn)盤至DP（DIC棱鏡）進(jìn)入光路樣品

13、聚焦（樣品要表面干凈），調(diào)節(jié)孔徑光欄與光照強(qiáng)度至最佳浮雕效果（調(diào)節(jié)視場(chǎng)光闌與視場(chǎng)外切，縮小孔徑光闌可增大反差）旋轉(zhuǎn)DIC調(diào)節(jié)鈕可調(diào)節(jié)背景干涉色，灰色到品紅色連續(xù)變化（100-600nm)背景黑色時(shí)為類暗場(chǎng)效果，灰色則獲得最大反差的三維圖像，品紅色則很小的光學(xué)延滯都可觀察到顏色變化，如結(jié)合可旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)則干涉差的方向靈敏性可表現(xiàn)出來(lái)。共四十六頁(yè)DIC滑行(huxng)器（U-DICT），上附檢偏器（U-ANT或U-AN）棱鏡控制(kngzh)旋鈕共四十六頁(yè)DIC顯微鏡下的硅藻(u zo) 共四十六頁(yè)七）熒光(ynggung)顯微鏡1 短波光照射樣品(yngpn)導(dǎo)致熒光分子被激發(fā)，分子能級(jí)躍遷，以

14、光子的形式釋放能量。2 光源：高壓汞燈，使用時(shí)需要預(yù)熱十五分鐘，斷電后十分鐘內(nèi)不能重啟。3 濾色鏡：包括激發(fā)光濾鏡和阻斷濾鏡。4 汞燈使用前需聚焦調(diào)中。共四十六頁(yè)激發(fā)(jf)模塊共四十六頁(yè)紫外防護(hù)罩共四十六頁(yè)汞 燈共四十六頁(yè)汞燈(n dn)調(diào)中檢驗(yàn)器共四十六頁(yè) 為了延長(zhǎng)高壓汞燈的使用壽命，一旦啟動(dòng)，不能在少于15分鐘內(nèi)關(guān)閉。關(guān)閉高壓汞燈后，至少10分鐘后才能再次啟動(dòng)。 轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤(zhunpn)或插入濾光片時(shí)始終要停在聽到卡嗒聲處。如果偏離這個(gè)位置，遮光板會(huì)由于過(guò)熱而變形。共四十六頁(yè)熒光顯微調(diào)節(jié)(tioji)裝置共四十六頁(yè)熒光(ynggung)顯微鏡使用注意事項(xiàng)1. 紫外光有害，注意保護(hù)眼、皮膚

15、2. 熒光弱，曝光時(shí)間長(zhǎng)，需注意防震3. 保護(hù)標(biāo)本，避免長(zhǎng)時(shí)間曝光對(duì)標(biāo)本的照射4. 標(biāo)本制作過(guò)程中要注意清潔、環(huán)境干凈(gnjng)5. 暗室條件共四十六頁(yè)八) 電子顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是用電子束作照明源，用電磁場(chǎng)作透鏡，放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬(wàn)倍。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右(zuyu)的超薄切片。共四十六頁(yè)共四十六頁(yè)透射(tu sh)電子顯微鏡 共四十六頁(yè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告簡(jiǎn)要闡述光學(xué)顯微(xin wi)鏡各種顯微(xin wi)功能的光路原理和調(diào)節(jié)使用方法；各種光學(xué)顯微鏡的使用注意事項(xiàng)。共四十六頁(yè)內(nèi)容摘要實(shí)驗(yàn)一、光學(xué)顯微鏡構(gòu)造和使用。1）分辨率：R=0.61 /N.A.。N.A.sin/2。 轉(zhuǎn)動(dòng)聚光鏡高度升降旋鈕(xun ni)把聚光鏡升高到最高位置。 通過(guò)調(diào)節(jié)聚光鏡升降旋鈕(xu