1、雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠的繁殖及其表型鑒定王志茹1,2,李軍2,劉曉梅1,吳紅聯(lián)2,朱德生2（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長(zhǎng)春 130021; 2.北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100871）【摘要】目的繁殖雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）小鼠，為進(jìn)行小鼠生殖系統(tǒng)毒性研究提供有效的工具。方法 將Ddx4-cre轉(zhuǎn)基因雄鼠與Rosa26mT/mG轉(zhuǎn)基因雌鼠交配，產(chǎn)生子代動(dòng)物，利用分子生物學(xué)、組織病理 學(xué)及活體成像等技術(shù)，分別從分子、細(xì)胞和組織水平對(duì)子代及其親代小鼠進(jìn)行表 型鑒定。結(jié)果 PCR結(jié)果表明在子代小鼠的睪丸組織中發(fā)生了Cre酶介導(dǎo)的特異性基因重組；活體成像可以看到在F1代

2、小鼠的睪丸組織中具有 GFP的表達(dá)；睪 丸冰凍切片及精子熒光觀察顯示GFP主要表達(dá)于次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中。結(jié)論雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá) GFP小鼠繁殖成功?！娟P(guān)鍵詞】睪丸；特異性；基因重組； GFPProduction and phenotype identification of specific expressedgreen fluorescent protein in male mice germ cellsWANG Zhi-ru1,2, LI Jun2, LIU Xiao-mei1, WU Hong-lian2, ZHU De-sheng2（1. School of publi

3、c health , Jilin University , Changchun 130021, China; 2. Peking University Laboratory animal centre , Beijing 100871 , China）Abstract Objective The aim of this study is production of organ specific animal model for studying reproductive toxicity in mice. Methods F1 generation was gotten by mating t

4、he Ddx4-cre transgenic male mice with the Rosa26mT/mG transgenic female mice. F1 offspring and its parents phenotype was screened by molecular biological, histopathological and in vivo imaging technology. Results At molecular level, specific DNA fragment was only found in testis of F1 offspring ; At

5、 the organ level, the expression of green fluorescent protein could only be observed in testis of F1 offspring; Testicular frozen sections and sperm fluorescence observation showed that green fluorescent protein were mainly expressed in the germ cell lineage such as secondary spermatocyte and sperma

6、tocyte and spermatozoon. Conclusions The production of the mice with specific germ cell expressed green fluorescent protein by Cre/loxP recombination system were built successfully.【Key words】 Testis;Specificity; Gene recombination;Green fluorescent protein 生殖系統(tǒng)的改變是造成不孕不育的重要原因，如何簡(jiǎn)易快速的檢作者簡(jiǎn)介王志茹（1988-）

7、女，在讀碩士研究生，研究方向：納米毒理學(xué)，Email: HYPERLINK mailto:843872569 843872569通訊彳者朱德生（1960-）男，高級(jí)工程師，研究方向：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物， Email ： HYPERLINK mailto:deshengz deshengz測(cè)生殖系統(tǒng)的損傷是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在絕大多數(shù)物種中，Ddx4基因特異性表達(dá)于生殖細(xì)胞中1,常被用作分子標(biāo)記研究配子發(fā)生和 原始生殖細(xì)胞的起源、遷移、分化等方面。雄性生殖細(xì)胞的DDX4蛋 白表達(dá)，從12.5dpc生殖崎一直持續(xù)到減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞2。本 研究利用生殖系統(tǒng)特異性啟動(dòng)子 Ddx4啟動(dòng)的Cre酶，通過Cr

8、e/loxP 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)網(wǎng)產(chǎn)生雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá) GFP小鼠模型， 為后續(xù)進(jìn)行雄性小鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育和毒性研究提供理想的動(dòng)物模型。1材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí) B6.FVB-Tg（Ddx4-cre）1Dcas/JnjuDdx4-cre 小鼠（以下簡(jiǎn)稱 為Ddx4-cre小鼠）4只，雌雄各半，雄性為雜合子（T/W）,雌性為 純合子（T/T）; SPF級(jí) B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato,-GFP）Luo 小鼠（以下簡(jiǎn)稱 Rosa26mT/mG小鼠）4只，雌雄各半，均為純合子 （mut/mut）。小鼠周齡4-8周，均購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)

9、藥研究院 【SCXK （蘇）2010-0001】。飼養(yǎng)于北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【使用許 可證：SYXK （京）2011-0003】，飼養(yǎng)條件符合SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼 養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。Ddx4-cre小鼠在Ddx4啟動(dòng)子調(diào)控下在生殖系統(tǒng)中特異性表達(dá) Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠4。Rosa26mT/mG小鼠是全身組織器官表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，當(dāng)其與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配產(chǎn)生的后代將發(fā) 生Cre酶介導(dǎo)的特異性基因重組，將敲除 mT基因，從而激活mG基 因的表達(dá)，產(chǎn)生綠色熒光蛋白(圖1)。動(dòng)物交配Ddx4-cre小鼠4只，雌雄各半，雄性為雜合子，雌性為純合子， 1:1交配，擴(kuò)大種群。Rosa26小鼠4只，雌雄各

10、半，均為純合子，1:1交配，擴(kuò)大種 群。Ddx4-cre小鼠6只,雄性，雜合子(T/W);與Rosa26小鼠6只, 雌性，純合子(mut/mut); 1: 1交配，獲得F1代雄性小鼠，其基因 型可分為兩種 Ddx4-cre (T/W); Rosa26mT/mG(mut /wt)與 Ddx4-cre (W/W); Rosa26mT/mG (mut/wt)。而在表達(dá) Cre酶的組織，會(huì)產(chǎn) 生Cre酶誘導(dǎo)的基因重組，切除 mT基因。通過交配產(chǎn)生子代可能的 基因型和表型見圖2。FODdx4-cre t ( T/W) XRosa26mT/ + (mut/nmt)F1E Ddx4-cre (T/W) ;

11、Rosa26nnT/mG (mutM ) Ddx4-cre (W/W) ; Rosa26(nT/mG (mjt/wt)中睪姆且織發(fā)生基因重組：Ddx4-cre (T/W) : Rosa26mG Cmut/wt)其它組織未發(fā)生基因重組：Ddx4-cre (T/W) ; Rosa26mT/mG nnuf Mt )翌丸組織呈現(xiàn)綠色熒光其它組織呈現(xiàn)紅鰥光圖2 Ddx4-cre 3小鼠與Rosa26mT/mG?小鼠交配可能產(chǎn)生的子代的基因型和表型FIG.2 Genotype and phenotype of offspring by mating the Ddx4-cre male mice with

12、theRosa26mT/mG female mice1.3雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠的篩查利用PCR的方法，對(duì)母代和子代雄性小鼠進(jìn)行基因型鑒定。提取鼠尾DNA, PCR擴(kuò)增檢測(cè) Ddx4-cre基因和Rosa26mT/mG基因，確定小鼠基因型，篩選基因型為 Ddx4-cre(T/W); Rosa26mT/mG(mut/wt)的子代小鼠，為雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠。Ddx4-cre基因擴(kuò)增條件為 94 c 30sec, 62 c 35sej 72 c 45sej 35 個(gè)循環(huán)；Rosa26mT/mG基因擴(kuò)增條件為 94c 30sec, 61c 1min, 72c 1min, 35個(gè)循環(huán)。所使用的引物及其意

13、義見表1。表1 PCR引物、擴(kuò)增片段及目的Table 1 PCR primer ,fragment size and purpose基因 GenesF (5 -3)R (5 -3)擴(kuò)增片段 fragment size目的 purposeDdx4-creCACGTGCAGCCGTTTAAGCCGCGTTTCCCA TTCTAAACAACACCCTGAA240bp (T/W)確定 F1 雄性小鼠是否攜帶了其父代白勺Ddx4-cre基因Rosa26 mT/mG TTCCCA TTCTAAACAACACCCTGAA CGAGGCGGATCACAAGCAA TA250bp ( mut/mut); 確定

14、F1 雄性小鼠是否攜帶了其母 TCAA TGGGCGGGGGTCGTT300bp ( wt/wt )代白勺 Rosa26mT/mG 基因mT AGCTGGACATCACCTCCCACAACG CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG1262bp驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)鼠的睪丸組織是否發(fā)生了 cre酶介導(dǎo)的基因重組動(dòng)物分組為了研究通過交配產(chǎn)生的動(dòng)物的基因型和表型，我們選取三組動(dòng)物。Ddx4-cre小鼠4只，雄性，周齡 4-5周，為陰性對(duì)照鼠；Rosa26mT/mG小鼠4只，雄性，周齡4-5周，為紅色熒光蛋白對(duì)照鼠；雙陽(yáng)性F1代小鼠4只，雄性，周齡4-5周為實(shí)驗(yàn)鼠。DNA提取利用濃鹽法提取組織 DNA6,加入

15、500口(含5/蛋白酶K)的組織裂解液放到52c恒溫水浴箱中消化過液，加入 5MNaCl 250l,混勻，冰浴10min。12000rpm,離心10min,吸上清400口 加入1ml預(yù)冷的無(wú)水乙醇，12000rpm離心10min后去上清，干燥沉淀后 加入60“去離子水55 c溶解DNA。PCR擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)體系為 20”,包括：10XBuffer 2屋，2.5mMdNTP 1.6 ”,10 w m引物各0.4 6, 5U rTaq酶0.4膜，模板DNA 1 ”,去離 子水14.2。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。組織mT基因擴(kuò)增利用三組動(dòng)物的睪丸組織（去除被膜組織）及實(shí)驗(yàn)鼠的腦、心、

16、 肝、脾、肺、腎、腸，提取 DNA, PCR擴(kuò)增檢測(cè)mT基因。引物與 目的片段（表1）。擴(kuò)增條件為94c 30sec, 61c 30sec, 72c 1min, 35個(gè)循環(huán)。組織熒光觀察頸椎脫臼法處死小鼠，取出腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸， 利用小動(dòng)物成像儀進(jìn)行離體組織的熒光觀察，紅色熒光（激發(fā)光 536/40nm;發(fā)射光590/20nm）;綠色熒光（激發(fā)光 425/26nm;發(fā)射 光520/35nm）,曝光時(shí)間均為1s。組織冰凍切片的熒光觀察將固定于4%甲醛溶液中的組織，轉(zhuǎn)入6-10ml 30%蔗糖溶液中沉 糖過夜，用OCT膠包埋，儲(chǔ)存于-20C冰箱中，備用。利用冰凍切片 機(jī)進(jìn)行組織切片

17、（10m）,無(wú)水乙醇固定，DAPI染色，封片，觀察。 1.10精子熒光觀察分離附睪置于1ml生理鹽水，將附睪橫切為若干段，用眼科鐐子 輕輕擠壓附睪組織塊，去掉附睪。靜止 5min,熒光顯微鏡觀察精子 災(zāi)就。2結(jié)果雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠的篩查通過F1代雄鼠鼠尾DNA PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖3、圖4）證明1-4號(hào)F1代雄性小鼠攜帶了父代的 Ddx4-cre基因和母代的Rosa26mT/mG基因25。匕pw圖3 Ddx4-cre基因PCR電泳圖 圖4 Rosa26mT/mG基因PCR電泳圖注：M： Maker DL2000 ; “wt：野生型注：M ： Maker DL2000 ; “wt：野生型PCR

18、 electrophoresis of Ddx4-creNote： M represents Maker DL2000 ；“wt represents wild typePCR electrophoresis of Rosa26mT/mGNote: M represents Maker DL2000； “wt Represents wild type組織mT基因的擴(kuò)增雙陽(yáng)性F1小鼠mT基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示只有睪丸組織 DNA不能 擴(kuò)增出mT基因（圖5）。雙陽(yáng)性F1代小鼠睪丸組織mT基因的擴(kuò)增 結(jié)果和其親代鼠的睪丸組織 DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖6, F1代小 鼠睪丸組織未能擴(kuò)增出 mT基因，而其

19、親代的Rosa26mT/mG鼠睪丸 組織DNA可以擴(kuò)增出mT基因。這表明雙陽(yáng)性F1小鼠睪丸組織在基 因水平上確實(shí)發(fā)生了 Cre酶介導(dǎo)的基因重組。整體器官熒光觀察小鼠的離體器官的小動(dòng)物成像觀察，雙陽(yáng)性 F1代鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸組織呈現(xiàn)紅色熒光，但睪丸組織可觀察到 綠色熒光而其他組織無(wú)綠色熒光（圖 7）。1 2345678 -V1262bp一 二 _一_.圖5 F1子鼠不同組織 mT基因PCR電泳圖注：1:腦；2：心；3：睪丸；4：肝；5：脾；6：肺；7：腎；8：腸；M ： Maker DL2000PCR results of mT gene in different tissu

20、e in F1 offspringNote： 1 ： brain ; 2 ： heart; 3： testis； 4： liver； 5： spleen； 6： lung； 7 ： kidny; 8： gut; M ： Maker DL2000M 1 2 3 -w 1262bp圖6親代和子代動(dòng)物睪丸組織mT基因PCR電泳圖注：1: F1睪丸組織DNA ; 2： Rosa26mT/mG鼠睪丸組織DNA ; 3： Ddx4-cre鼠睪丸組織DNA。PCR results of testicular tissue mT gene in F1 offspring and its parentsNote

21、： 1: the testis DNA of the F1 mouse;2： the testis DNA of the Rosa26mT/mG mouse;3 : the testis DNA of the Ddx4-cre mouse.組織學(xué)熒光觀察雙陽(yáng)性F1代小鼠和親代小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸組織冰凍切片結(jié)果觀察，發(fā)現(xiàn)只有在子代F1睪丸組織細(xì)胞中具有GFP的表達(dá)（圖8）, GFP主要表達(dá)于生精小管細(xì)胞中，且集中于次 級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中。精子熒光觀察倒置熒光顯微鏡觀察雙陽(yáng)性 F1代小鼠精子和Rosa26mT/mG鼠 精子，結(jié)果表明：F1代子鼠精子具有 GFP的表達(dá)，而

22、其親代的 Rosa26mT/mG小鼠的精子呈微弱的紅色熒光（圖 9）。3討論熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了生物學(xué)醫(yī)藥科學(xué)的研究。目前研究較廣泛的熒光蛋白為紅色熒光蛋白（RFP）和GFP,其中GFP享有 現(xiàn)代生物學(xué)北斗星的美譽(yù)，其具有熒光穩(wěn)定、易于檢測(cè)、表達(dá)調(diào)控簡(jiǎn) 單、生物安全性好等優(yōu)點(diǎn)7。本研究利用Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系 統(tǒng)制作雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá) GFP小鼠模型，這為我們后續(xù)研究 雄性小鼠生殖系統(tǒng)功能與毒性等領(lǐng)域提供理想的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)將Ddx4-cre雄鼠與Rosa26mT/mG雌鼠交配篩選體內(nèi)同時(shí) 具有Cre基因與Rosa26mT/mG基因的雙陽(yáng)性F1代雄性小鼠，對(duì)其 進(jìn)行基因

23、型和表型鑒定。mT基因的擴(kuò)增結(jié)果表明，僅在睪丸組織產(chǎn) 生了 mT基因的切除。而離體器官的熒光觀察結(jié)果表明F1代子鼠的睪丸組織具有GFP的表達(dá)，組織學(xué)熒光觀察結(jié)果證明 GFP主要表達(dá) 于生精小管細(xì)胞中，且集中表達(dá)于次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中。 而大量的文獻(xiàn)研究表明 DDX4蛋白在小鼠精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞 均有表達(dá)8,即精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞應(yīng)均具有 Cre酶的表達(dá)而發(fā) 生特異的基因重組，但在精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞卻未觀察到綠色熒 光，這可能是因?yàn)榇渭?jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中綠色熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，在同等條件下掩蓋了精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞的綠色熒光參考文獻(xiàn)Kakiuchi K, Tsuda A,

24、 Goto Y , Shimada T, Taniguchi K, Takagishi K, et al. Cell-Surface DEAD-Box Polypeptide 4-Immunoreactive Cells and Gonocytes Are Two Distinct Populations in Postnatal Porcine Testes. Biol Reprod. 2014;90.Fujiwara Y, Komiya T, Kawabata H, Sato M, Fujimoto H, Furusawa M, et al. Isolation of a Dead-Fam

25、ily Protein Gene That Encodes a Murine Homolog of Drosophila-Vasa and Its Specific Expression in Germ-Cell Lineage. P Natl Acad Sci USA. 1994;91:12258-62.Kage-Nakadai E, Imae R, Suehiro Y , Yoshina S, Hori S, Mitani S. A Conditional Knockout Toolkit for Caenorhabditis elegans Based on the Cre/loxP R

26、ecombination. Plos One. 2014;9.Gallardo T, Shirley L, John GB, Castellon DH. Generation of a germ cell-specific mouse transgenic Cre line, Vasa-Cre. Genesis. 2007;45:413-7.Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, Luo LQ. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 2007;45:593-605.Poh JJ

27、, Gan SKE. Comparison of customized spin-column and salt-precipitation finger-prick blood DNA extraction. Bioscience Rep. 2014;34:629-34.7張雨麗，張桂征，蘇紅梅，等.綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用J.生物技術(shù)通報(bào),2010(9):16-198 Toyooka Y , Tsunekawa N, Akasu R, Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. P Natl Acad Sci

28、 USA. 2003;100:11457-62.圖1 mT/mG基因發(fā)生Cre酶介導(dǎo)的基因重組前后的結(jié)構(gòu)示意圖5注：mT/mG由雞伊肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，CMV為增強(qiáng)子(PCA),在重組前，loxP位點(diǎn)間的tdTomato基因(mT)表達(dá)。在Cre 介導(dǎo)染色體內(nèi)基因重組，mT基因序列被切除， PCA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá)(mG)。箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。FIG. 1 Schematic diagram of the mT/mG construct before and after Cre-mediated5recombinationNote: mT/mG consists of a chicken -actin core promoter with a CMV enhancer (pCA) driving a loxP-flanked coding sequence ofmembrane-targeted tandem dimer Tomato (mT) resulting in tdTomato expression with membrane localization. After Cre-mediatedintra-chromosomal recombination, the mTsequence is excised allowing the pCA