1、工業(yè)發(fā)酵的工藝流程 生物發(fā)酵工藝多種多樣，但基本上包括菌種的選 育、菌種培養(yǎng)基的配制、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵 過(guò)程下游處理即分離提純等幾個(gè)過(guò)程。找到合適的菌種是發(fā)酵工程的前提。人們最初是從自然界尋找所需要的菌種，如谷氨酸發(fā)酵時(shí)常用菌有谷氨酸棒狀桿菌等。但這種方法得到的菌種，產(chǎn)量一般都比較低。20世紀(jì)40年代，微生物學(xué)家開始用紫外線、激光、化學(xué)誘變劑等處理菌種，使菌種產(chǎn)生突變，以篩選出符合要求的優(yōu)良菌種。隨著細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)的日益成熟，科學(xué)家開始構(gòu)建工程細(xì)胞或工程菌，用它們進(jìn)行發(fā)酵，甚至能生產(chǎn)出一般微生物所不能生產(chǎn)的產(chǎn)品。 一、菌種的選育菌種選育的必要性和重要性 必要性：1、經(jīng)誘變劑處理的

2、細(xì)胞中只有一部分是突變型菌株，而有害突變往往占有很大比例； 2、從自然界篩選得來(lái)的菌株，藥物代謝合成能力均很低，野生型菌株由于長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)在非最適條件下，產(chǎn)物濃度很低，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，如果不進(jìn)行菌種改良，勢(shì)必造成生產(chǎn)成本過(guò)高。 重要性：1、菌種選育是提高單位產(chǎn)量和改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量的重要措施； 2、能夠改變菌種的某些遺傳性狀，使之更適合于工業(yè)生產(chǎn)，例如抗噬菌體的菌株能利用廉價(jià)發(fā)酵原料或需氧量較小的菌株等。 選育方法1、自然選育：是指微生物細(xì)胞群體不經(jīng)過(guò)人工處理而利用菌種的自發(fā)突變（spontaneous mutation）進(jìn)行菌種篩選的育種方法。 效率低、進(jìn)展緩慢。2、誘變育種：是用不同的誘變劑（m

3、utagen）處理微生物的細(xì)胞群體，以誘發(fā)各種遺傳突變，然后采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中選出所需要的突變株（mutant）。發(fā)酵工業(yè)中使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過(guò)誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的菌株，故至今仍是菌種改良的主要方法。 （一）方法和原理 A.誘變機(jī)制（1）微小損傷突變：堿基置換，碼組移動(dòng)（2）染色體畸變：易位，逆位，缺失，重復(fù)（3）染色體組突變：數(shù)目變化（單倍體變多倍體） B.誘變劑及其作用方式：物理誘變劑，化學(xué)誘變劑，生物誘變劑常用誘變劑 p-263（二）誘變和篩選初步篩選是關(guān)鍵步驟A.自身耐藥突變株：耐受自身分泌的抗生素，提高產(chǎn)量B.結(jié)構(gòu)類似物或前體類似物的耐受突變株：解

4、除反饋抑制 C.營(yíng)養(yǎng)缺陷型及其回復(fù)突變株 通過(guò)誘變導(dǎo)致某些基因的突變，而需要添加一些物質(zhì)（氨基酸、核苷酸等）才能生長(zhǎng)的突變體。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的作用：（1）解除末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用。（2）作為標(biāo)記，在雜交育種中作為出發(fā)菌株有利于雜交重組的分析。（3）作為基因工程的受體菌，檢出克隆基因的表達(dá)。3、雜交育種：是將兩個(gè)基因型不同的親株的某些遺傳信息，通過(guò)雜交重組于同一重組體中，形成新的遺傳型個(gè)體的過(guò)程。傳統(tǒng)的雜交育種在真核微生物中可以通過(guò)有性雜交及準(zhǔn)性雜交兩種途徑；在原核微生物中（如細(xì)菌和放線菌）則可通過(guò)接合雜交進(jìn)行。 a. 準(zhǔn)性生殖（parasexual reproduction）：是指真菌中不通過(guò)

5、有性生殖的基因重組過(guò)程。 b. 接合（conjugation）：在細(xì)菌和放線菌中，接合是最常見的雜交方式。二親株的細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)時(shí)，一親株細(xì)胞的基因組片段進(jìn)入另一親株的細(xì)胞，發(fā)生部分染色體的轉(zhuǎn)移或遺傳信息的交換，形成部分合子，經(jīng)過(guò)二次交換形成單倍重組體。 c. 原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）：兩親本菌株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，以聚乙二醇作為助融劑，或在一定電場(chǎng)條件下，通過(guò)電脈沖作用促進(jìn)原生質(zhì)體互相聚集，誘導(dǎo)融合，接著兩親本遺傳物質(zhì)交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。在適宜的條件下，融合細(xì)胞可再生成新的完整細(xì)胞，就有可能獲得具有合乎理想的新遺傳性狀的重組子。二、發(fā)酵的基本

6、過(guò)程基本過(guò)程為： 菌種 種子制備 發(fā)酵 發(fā)酵液預(yù) 處理 提取精制 菌種發(fā)酵工程中所用的菌種多要求是純培養(yǎng)的，即整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不能混有雜菌，否則將導(dǎo)致產(chǎn)量大大下降，甚至得不到產(chǎn)品。例如，如果青霉素生產(chǎn)過(guò)程中污染了雜菌，這些雜菌會(huì)分泌青霉素酶，將形成的青霉素分解掉。因此，培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌。種子制備在搖瓶或小罐內(nèi)進(jìn)行。種子罐一般用鋼或不銹鋼制成，相當(dāng)于小型發(fā)酵罐。接種前所有設(shè)備及培養(yǎng)基要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌。在大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中，需要將選育出的優(yōu)良菌種經(jīng)過(guò)多次擴(kuò)大培養(yǎng)，讓它們達(dá)到一定數(shù)量以后，再進(jìn)行接種。發(fā)酵接種量：5-20%通氣量：0.3-1 m3/m3攪拌功率消耗：1-2 kW/m3罐

7、溫：26-37罐壓：0.3-0.5 kg/cm2發(fā)酵周期：28d 發(fā)酵結(jié)束后，要對(duì)發(fā)酵液或生物細(xì)胞進(jìn)行分離和提取精制，將發(fā)酵產(chǎn)物制成合乎要求的產(chǎn)品。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的要求不同，分離提純的方法也相應(yīng)有些區(qū)別。利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的產(chǎn)品有菌種代謝產(chǎn)物和菌種本身（如酵母菌和細(xì)菌）兩大類，如果產(chǎn)品是菌種，分離方法一般是通過(guò)過(guò)濾、沉淀從培養(yǎng)液中分離出；如果產(chǎn)品是代謝產(chǎn)物，則采用蒸餾、萃取、離子交換等方法提取。分離提純后的產(chǎn)品，還要經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢查合格后，才能成為正式產(chǎn)品。產(chǎn)物提取發(fā)酵方式1、分批(間歇)發(fā)酵：物料一次投入反應(yīng)器中，滅菌、接種、發(fā)酵。 特點(diǎn)：一次性；發(fā)酵過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)不斷減少，微生物不斷增殖，環(huán)境非穩(wěn)態(tài)；微生物生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期明顯； 應(yīng)用廣泛，改善（在線檢測(cè)，計(jì)算機(jī)控制）。 2、補(bǔ)料分批發(fā)酵 ：補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基。 特點(diǎn)：可以解除底物抑制、產(chǎn)物抑制或克服微生物過(guò)度生長(zhǎng)；提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率； 應(yīng)用廣泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工業(yè)；3、連續(xù)發(fā)酵：恒化器（基質(zhì)恒）、恒濁器（菌體密度恒