1、 浙江工業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文） PAGE XVII PAGE IV本科畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文）（2014屆）題目： 嬰幼兒配方奶粉中強(qiáng)化維生素B12的檢測(cè)技術(shù)研究學(xué)生姓名 學(xué) 號(hào) 指導(dǎo)教師 專(zhuān)業(yè)班級(jí) 所在學(xué)院 提交日期 2014年6月 PAGE 25 浙江工業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文） PAGE I嬰幼兒配方奶粉中強(qiáng)化維生素B12的檢測(cè)技術(shù)研究摘要 本實(shí)驗(yàn)采用免疫親和柱/超高效液相色譜（UPLC）與免疫親和柱/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中維生素B12的含量。樣品用0.05 mol/L的醋酸鈉除蛋白，采用免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，濾液通過(guò)Wa

2、ters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm 100 mm 1.7 m）色譜柱分離，進(jìn)樣體積5 L，柱溫35 ，流速0.2 mL/min，UPLC的流動(dòng)相為0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)至pH 3.5）-乙腈（85 : 15）等度洗脫。UPLC-MS/MS的流動(dòng)相為0.1%的甲酸水和甲醇梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI）正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），定量離子（m/z）為678.3/147。維生素B12在10 g/L - 500 g/L范圍內(nèi)有良好的線性，相關(guān)系數(shù)R達(dá)到0.999，檢出限為0.5 ng/g，定量限為1.5 ng/g。UPLC法測(cè)定維生素

3、B12的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2 - 3.0%，加標(biāo)回收率在92.0 - 93.1% （n = 3），UPLC-MS/MS法測(cè)定維生素B12的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4 - 8.7%，加標(biāo)回收率在85.0 - 110.3%（n = 3）。本方法分析速度快，靈敏度高，重復(fù)性好，適用于嬰幼兒奶粉中低含量維生素B12的檢測(cè)。 關(guān)鍵詞：維生素B12，免疫親和柱，嬰幼兒配方奶粉，超高效液相色譜，超高效液相色譜-質(zhì)譜Study ON THE DETECTION of vitamin B12 in infant formula milk powderABSTRACTThe method for the determi

4、nation of vitamin B12 in infant formula milk powder was established by immunoaffinity column/ultra perf-ormance liquid chromatography（UPLC）and immunoaffinity column/ /ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.After being treated by 0.05 mol/L sodium acetate to precipitate

5、 the milk protein, the sample was purified by immunoaffinity column, the filtrate was separated by Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm 100 mm 1.7 m）column, the injection volume was 5 L at a flow-rate of 0.2 mL/min and the column temperature was 35 oC. The mobile phase of UPLC consisted of 0.03 mol/L

6、 potassium dihydrogen phosphate（pH 3.5） and acetonitrile（85 : 15） with isocratic elution, the mobile phase of UPLC-MS/MS consisted of 0.1% formic acid water and methanol gradient elution. The sample was analyzed by using multiple reaction monitoring（MRM）mode, electrospray ionization（ESI）source and s

7、electing（m/z）678.3/147 as quantitative production. The calibration curve was linear in the range of 10 - 500 g/L, with a correlation coefficient of 0.999. The detection limit of method was 0.5 ng/g and the quantification limit was 1.5 ng/g. The relative standard deviation of the determination of vit

8、amin B12 by UPLC was 0.2 - 3.0%, the recovery rate was between 92.0% - 93.1% (n = 3), the relative standard deviation of the determination of vitamin B12 by UPLC-MS/MS was 3.4 - 8.7%, the recovery rate was between 85.0% - 110.3% (n = 3). Due to its short operation time, high sensitivity and good rep

9、roducible, the proposed method can be used to determine vitamin B12 in infant formula milk powder. Key words: vitamin B12, immunoaffinity column, infant formula milk powder, ultra high performance liquid chromatography, ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry 目 錄 TOC o 1-3 h z

10、 u HYPERLINK l _Toc3944 摘要 HYPERLINK l _Toc6687 ABSTRACT PAGEREF _Toc6687 II HYPERLINK l _Toc22969 第一章 緒論 PAGEREF _Toc22969 1 HYPERLINK l _Toc7579 1.1 維生素B12的概述及功能 PAGEREF _Toc7579 1 HYPERLINK l _Toc9236 1.2 維生素B12檢測(cè)技術(shù)研究意義 PAGEREF _Toc9236 1 HYPERLINK l _Toc19390 1.3 國(guó)內(nèi)外對(duì)維生素B12的檢測(cè)方法 PAGEREF _Toc1939

11、0 2 HYPERLINK l _Toc20266 1.3.1 微生物法 PAGEREF _Toc20266 2 HYPERLINK l _Toc4760 1.3.2 固相萃取一二維液相色譜法 PAGEREF _Toc4760 3 HYPERLINK l _Toc26734 1.3.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 PAGEREF _Toc26734 4 HYPERLINK l _Toc11008 1.3.4 熒光光度法 PAGEREF _Toc11008 5 HYPERLINK l _Toc27067 1.3.5 免疫親和柱凈化/高效液相色譜法 PAGEREF _Toc27067 6 HYPE

12、RLINK l _Toc25126 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 PAGEREF _Toc25126 9 HYPERLINK l _Toc17216 2.1 主要儀器與裝置 PAGEREF _Toc17216 9 HYPERLINK l _Toc18514 2.2 主要試劑與材料 PAGEREF _Toc18514 9 HYPERLINK l _Toc27054 2.3 樣品預(yù)處理 PAGEREF _Toc27054 9 HYPERLINK l _Toc14031 2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 PAGEREF _Toc14031 10 HYPERLINK l _Toc13056 2.5 色譜條件 PAGEREF

13、_Toc13056 10 HYPERLINK l _Toc28192 2.5.1 UPLC色譜條件 PAGEREF _Toc28192 10 HYPERLINK l _Toc24148 2.5.2 LC-MS/MS的色譜條件 PAGEREF _Toc24148 10 HYPERLINK l _Toc22255 2.6 質(zhì)譜條件 PAGEREF _Toc22255 11 HYPERLINK l _Toc18344 第三章 結(jié)果與討論 PAGEREF _Toc18344 12 HYPERLINK l _Toc850 3.1 樣品前處理的優(yōu)化 PAGEREF _Toc850 12 HYPERLINK

14、 l _Toc3713 3.2 色譜條件的優(yōu)化 PAGEREF _Toc3713 12 HYPERLINK l _Toc15197 3.3 方法學(xué)驗(yàn)證 PAGEREF _Toc15197 15 HYPERLINK l _Toc28354 3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限 PAGEREF _Toc28354 15 HYPERLINK l _Toc30487 3.4 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與回收率實(shí)驗(yàn) PAGEREF _Toc30487 17 HYPERLINK l _Toc17725 3.5 樣品分析 PAGEREF _Toc17725 18 HYPERLINK l _Toc31053 第四章 總結(jié)

15、與展望 PAGEREF _Toc31053 20 HYPERLINK l _Toc17858 4.1 總結(jié) PAGEREF _Toc17858 20 HYPERLINK l _Toc6625 4.2 展望 PAGEREF _Toc6625 20 HYPERLINK l _Toc22204 參考文獻(xiàn)22 HYPERLINK l _Toc22204 致謝24 HYPERLINK l _Toc22204 附錄25 HYPERLINK l _Toc22204 附錄1 畢業(yè)設(shè)計(jì)開(kāi)題報(bào)告25 HYPERLINK l _Toc22204 附錄2 畢業(yè)設(shè)計(jì)文獻(xiàn)綜述25 HYPERLINK l _Toc2220

16、4 附錄3 畢業(yè)設(shè)計(jì)外文翻譯（中文與外文原文）25浙江工業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文）PAGE 1第一章 緒論 1.1 維生素B12的概述及功能 維生素B12又稱(chēng)抗惡性貧血維生素，是一種由含鈷的卟啉類(lèi)化合物組成的B族維生素。維生素B12是經(jīng)過(guò)20年的研究，在1948年才從肝臟中分離出來(lái)，它是一種具有控制惡性貧血效果的紅色晶體物質(zhì)，是B族維生素中發(fā)現(xiàn)最晚的一種。維生素B12在pH值4.5 - 5.0弱酸條件下能夠穩(wěn)定存在，易溶于乙醇和水，強(qiáng)酸（pH 200 ng；儲(chǔ)存條件：2 - 8 ，切勿冷凍。本實(shí)驗(yàn)采用免疫親和柱作為樣品前處理技術(shù)。維生素B12免疫親和柱的操作流程示圖如圖1.1所示。圖1.

17、1 維生素B12免疫親和柱的操作流程示圖吳楠等14建立了免疫親和柱凈化/高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中維生素B12的方法。采用磷酸鹽緩沖液使樣品完全溶解后，通過(guò)維生素B12免疫親和柱、甲醇洗脫、濃縮富集后就可直接測(cè)定。經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后，維生素B12在20 - 300 g/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.9997，檢出限為0.6 g /kg；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1% - 2.4%；樣品的加標(biāo)回收率為90% - 96%。Marley 等15的研究中使用了EASI-EXTRA 免疫親和柱對(duì)功能性飲料等樣品進(jìn)行提取分析，配合HPLC-UV檢測(cè)，取得了較好的重現(xiàn)性。檢測(cè)限0.44 g/100

18、g，變異系數(shù)在0.8% - 10%之間。Heudi 等16使用免疫親和柱對(duì)奶粉中維生素B12進(jìn)行測(cè)定，定量限為2.5 ng/g，回收率為94% - 100%。已經(jīng)能滿(mǎn)足調(diào)制乳粉及嬰幼兒配方奶乳粉中微量維生素B12含量的測(cè)定要求。免疫親和法由于其自身特性，適合對(duì)高雜質(zhì)、低含量樣品中的維生素B12進(jìn)行分析，結(jié)合液相色譜且具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確與靈敏度高等特點(diǎn)，可滿(mǎn)足乳粉類(lèi)復(fù)雜基質(zhì)樣品中微量維生素B12的測(cè)定要求。但是免疫親合法具有處理樣品量少、價(jià)格不菲，免疫親和柱保存條件苛刻的缺點(diǎn)。 第二章 實(shí)驗(yàn)部分2.1 主要儀器與裝置AcquityTM超高液相色譜儀、XevoTMTQ-MS質(zhì)譜儀配有電噴霧

19、電離接口（ESI）及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）和固相萃取裝置（美國(guó)Waters公司）,Milli-Q超純水器（美國(guó)Milipore公司），高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），氮吹儀（天津市恒奧科技有限公司），渦旋混合器（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Whatman S&S 5971/2濾紙。2.2 主要試劑與材料維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99.5%），購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；EASI-EXTRACT VITAMIN B12（LGE）維生素B12免疫親合柱（德國(guó)R-Biopharm）。甲醇、乙腈:色譜純（德國(guó)Merck公司）；甲酸，磷酸

20、二氫鉀：色譜純（美國(guó)TEDIA)公司；醋酸鈉：分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為Milli-Q系統(tǒng)純化水。pH = 4.0的醋酸鈉溶液的配制：稱(chēng)取4.1 g醋酸鈉于1 L的燒杯中，加950 mL去離子水，完全溶解后用醋酸調(diào)節(jié)pH = 4.0，再用去離子水定容至1000 mL。pH = 3.5磷酸二氫鉀溶液的配制：稱(chēng)取4.1 g磷酸二氫鉀于1 L的燒杯中，加800 mL去離子水，完全溶解后用磷酸調(diào)節(jié)pH = 3.5。2.3 樣品預(yù)處理 樣品提?。悍Q(chēng)取1.00 g樣品至錐形瓶中，加入50 mL醋酸鈉緩沖液，將樣品液均勻移入兩個(gè)50 mL離心管中，渦旋混勻，超聲提取5 min，震搖10 min

21、，10000 r/min條件下離心5 min，取上層液，使用Whatman S&S 5971/2濾紙過(guò)濾，得到澄清濾液。免疫親和柱凈化與富集：將免疫親和柱置于固相萃取裝置上，放出柱中的保存液后（不能流干），將全部濾液經(jīng)過(guò)免疫親和柱，中間不能有樣液流完現(xiàn)象，用10 ml蒸餾水淋洗免疫柱，吹干柱內(nèi)殘留液。加入3 mL100%甲醇，蓋上密封帽浸泡10 min，用15 mL玻璃管接收洗脫液，排干柱內(nèi)液體，再用3 mL100%甲醇，蓋上密封帽浸泡10 min，用第一次接收管接收洗脫液。在45 氮?dú)獯蹈? 1 mL水定容，過(guò)0.22 m濾膜。2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取2 mg維生素B12（ 0.0001

22、），用純水溶解，并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成20 g/mL的維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 避光保存。各取20 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5，10，20，50，75，150，200，250 L于10 mL的容量瓶，定容至10 mL配制濃度為10，20，40，100，150，300，400，500 L/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.5 色譜條件2.5.1 UPLC色譜條件色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm 100 mm 1.7 m）色譜柱分離；進(jìn)樣體積：5 L；柱溫：35 ；樣品溫度：25 ；流速：0.2 mL/min。流動(dòng)相：0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液

23、（用磷酸調(diào)至pH 3.5）乙腈（8515）等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)361 nm。2.5.2 LC-MS/MS的色譜條件LC條件：AcquityTM超高液相色譜儀和XevoTMTQ-MS質(zhì)譜儀聯(lián)用。色譜柱：Waters Acquity C18（2.1 mm 100 mm 1.7 m）；流速為0.25 mL/min；進(jìn)樣體積5 L；柱溫35 ；樣品溫度：25 。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水，流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序如表2.1。 表2.1 梯度洗脫程序時(shí)間（min）0.1% 甲酸水（%）甲醇（%）080202.080204.520805.020805.580208.080202.6 質(zhì)譜條件 離子源：電噴

24、霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓為2.8 KV，離子源溫度為150 ，脫溶劑氣溫度為500 ，脫溶劑氣流量為1000 L/h，維生素B12的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2.2。 表2.2 維生素B12的質(zhì)譜參數(shù)化合物保留時(shí)間 min檢測(cè)離子錐孔電壓/V碰撞能量/eV維生素B123.44678.3/147*4528678.3/3594530 *離子對(duì)為定量離子對(duì) 第三章 結(jié)果與討論3.1 樣品前處理的優(yōu)化 由于嬰幼兒奶粉成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量較高，會(huì)對(duì)檢測(cè)造成較大的干擾，選擇好的萃取溶劑顯得至關(guān)重要。為了降低蛋白質(zhì)等干擾物對(duì)免疫親和柱的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)除蛋白進(jìn)

25、行了優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)分別選取 pH = 4.0 的醋酸鈉溶液、乙腈、三氯乙酸和醋酸鋅與亞鐵氰化鉀溶液（V : V = 1 : 1）作為沉淀蛋白劑，比較其提取的效果。乙腈、三氯乙酸和醋酸鋅與亞鐵氰化鉀溶液（V : V = 1 : 1）雖然沉淀蛋白的效果很好，但維生素B12被沉淀物包裹，影響維生素B12的回收，且不利于免疫親和柱凈化，回收率差。采用pH = 4.0的醋酸鈉溶液沉淀蛋白質(zhì)，不但效果好，而且回收率好，所以本實(shí)驗(yàn)選用pH = 4.0的醋酸鈉溶液作為提取溶劑。3.2 色譜條件的優(yōu)化高效的色譜柱是多組分分析的前提條件，本實(shí)驗(yàn)選用Waters Acquity uplc UPLC BEH C18（2

26、.1 mm 100 mm 1.7 m）色譜柱進(jìn)行分析，此色譜柱具有很好的低pH穩(wěn)定性，使得UPLC BEH C18色譜柱具有最寬的pH操作范圍，還能提供尖銳對(duì)稱(chēng)的色譜峰，最高的柱效和LC-MS檢測(cè)靈敏度。此色譜柱對(duì)維生素B12具有較強(qiáng)的保留，且雜質(zhì)干擾小，分離效果好。分別選擇甲醇和乙腈作為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相，10 mmol/L的醋酸鈉、0.1%的甲酸水和0.03 mol/L的磷酸二氫鉀（pH = 3.5) 作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)證明:UPLC法采用乙腈和0.03 mol/L的磷酸二氫鉀（pH = 3.5) =（85:15）作為流動(dòng)相時(shí)，能得到最佳靈敏度，且出峰效果和分離效果都是最佳的。如果改變流動(dòng)相體系中

27、磷酸二氫鉀和乙腈的比例，會(huì)影響出峰時(shí)間和出峰效果。磷酸二氫鉀是鹽類(lèi)，作為流動(dòng)相時(shí)，進(jìn)樣前，色譜柱需要用五倍柱體積的10%乙腈水沖洗，使用完后，用純水沖洗，再用乙腈沖洗，是為了避免磷酸二氫鉀在色譜柱內(nèi)析出，損壞色譜柱。UPLC-MS/MS采則用甲醇和0.1%的甲酸水梯度洗脫時(shí)，能增加維生素B12在ESI+模式下的離子化效率，改善峰形，離子化條件最佳，峰面積信號(hào)最強(qiáng)。維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品色譜圖如圖3.1、圖3.2、圖3.3、圖3.4。圖中可以看到，在最佳色譜條件下，待測(cè)物附近無(wú)雜質(zhì)峰，分離效果好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，且峰形對(duì)稱(chēng)性強(qiáng)。 圖3.1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品超高效液相色譜圖圖3.2 樣品維生素

28、B12超高效液相色譜圖圖3.3 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖 圖3.4 樣品維生素B12超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖 3.3 方法學(xué)驗(yàn)證3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限取濃度分別為10，20，40，100，150， 300，400，500 g/L一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用UPLC，UPLC-MS/MS測(cè)定，以峰面積做為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度做為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),如圖3.5。結(jié)果表明，UPLC，UPLC-MS/MS測(cè)定維生素B12在10 - 500 g/L范圍內(nèi)都有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均在0.999以上。根據(jù)樣品取樣情況，以3倍信噪比作為

29、儀器對(duì)的檢出限，10倍信噪比作為定量下限，維生素B12的檢出限和定量限見(jiàn)表3.1。表3.1 維生素B12的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限方法線性方程相關(guān)系數(shù)檢出限（g/kg)定量限（g/kg)液相法Y = 194.458x + 71.4720.99940.51.5質(zhì)譜法Y = 216.751x - 338.3950.99950.51.5Area Concentration (a)Response Concentration (b)圖3.5 (a.超高效液相線性曲線，b.超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜線性曲線)3.4 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與回收率實(shí)驗(yàn) 選取不含維生素B12的全脂牛奶當(dāng)做空白樣品。稱(chēng)量三份空白樣

30、品液，分別加入5，25，50 L，20 mg/L維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本文“2.3”步驟處理后，平行測(cè)定三次，分別用UPLC和UPLC-MS/MS測(cè)定其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與回收率。結(jié)果見(jiàn)表3.3、表3.4。UPLC測(cè)定的加標(biāo)回收率范圍為92.0% - 93.1%，平均加標(biāo)回收率為92.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2% - 3.0%。UPLC-MS/MS測(cè)定的加標(biāo)回收率范圍為85.2% - 110.5%，平均加標(biāo)回收率為98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4% - 8.7%。 表3.2 UPLC空白樣品中維生素B12的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差樣品序號(hào)加標(biāo)量/g/L實(shí)測(cè)值/g/L平均值/g/L回收率 %相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏

31、差%12319.292.03.02500471.5461.7463.2465.593.10.731000921.5932.6937.4930.593.10.2 表3.3 UPLC-MS/MS空白樣品中維生素B12的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差樣品序號(hào)加標(biāo)量/g/L實(shí)測(cè)值/g/L平均值/g/L回收率 %相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%1231108.810.310.89.999.07.62500480.1584.5592.5552.3110.58.731000809.0852.9894.1852.0 樣品分析分別稱(chēng)取奶粉專(zhuān)用復(fù)合維生素添加劑0.50 g，嬰幼兒奶粉1.00 g于5

32、0 mL的離心管，加入50 mL醋酸鈉緩沖液，渦旋混勻，超聲提取5 min,震搖10 min，10000 r/min條件下離心5 min，取上層液，使用Whatman S&S 5971/2濾紙過(guò)濾，得到澄清濾液。經(jīng)過(guò)免疫親和柱凈化與富集后，用UPLC檢測(cè)，并按下式計(jì)算結(jié)果。并與微生物法所測(cè)的結(jié)果比較如表3.4所示。 樣品中維生素B12含量（g/L） = 式中: A1- 樣品面積（mm2） A2- 標(biāo)樣面積（mm2） V- 樣液體積（mL） m- 樣品質(zhì)量（g) C- 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（g/L)表3.4 維生素B12的檢測(cè)結(jié)果樣品編號(hào)樣品名稱(chēng)液相法測(cè)定值 g/kg質(zhì)譜法測(cè)定值 g/kg微

33、生物法測(cè)定值 g/kg標(biāo)簽明示值 g/kg1嬰幼兒配方奶粉33.135.741.1 12.22寶寶成長(zhǎng)奶粉28.230.535.0 12.23初生嬰兒奶粉26.227.332.28.3 - 78.34嬰幼兒配方奶粉22.520.227.4 7.65幼兒成長(zhǎng)奶粉 8.7第四章 總結(jié)與展望4.1 總結(jié) 從1948年至今發(fā)現(xiàn)維生素B12的檢測(cè)方法發(fā)展迅速，但由于維生素B12在食物中的含量較低并且有多種形態(tài)和相似物，因此給食品中測(cè)定維生素B12帶來(lái)較大困難。雖然微生物法的高靈敏度和可靠性已得到國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。但微生物法操作復(fù)雜，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素很多，如內(nèi)源性物質(zhì)的干擾就

34、是一個(gè)不可避免的因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微生物法的測(cè)定值比超高效液相與超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定值高，這就是內(nèi)源性物質(zhì)的干擾所造成的結(jié)果。微生物分析法不能有效區(qū)分維生素B12與內(nèi)源性物質(zhì)，導(dǎo)致結(jié)果偏高。本實(shí)驗(yàn)采用免疫親和柱/超高液相色譜與免疫親和柱/超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中維生素B12的含量，雖然奶粉成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量較高，基質(zhì)效應(yīng)大，但奶粉樣品經(jīng)過(guò)免疫親和柱凈化后，能有效地去除基質(zhì)的干擾，與微生物法相比，方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、回收率高且穩(wěn)定、定量結(jié)果的準(zhǔn)確性更高，方法檢出限為0.5 ng/g，能滿(mǎn)足嬰幼兒奶粉中維生素B12強(qiáng)化不少于8 ng/g的要求，可用于實(shí)際

35、樣品的檢測(cè)。本方法為新測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中維生素B12方法的建立提供了可行性。4.2 展望隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)其提取、分析等檢測(cè)技術(shù)方面取得了很大進(jìn)步。樣品的前處理是檢測(cè)維生素B12的關(guān)鍵技術(shù)。酶水解法在溫和條件下可以促進(jìn)樣品中維生素B12的釋放，富集凈化時(shí)可以利用固相萃取柱或免疫親和柱對(duì)維生素B12進(jìn)行富集凈化，免疫親和柱的高特異性吸附可以快速簡(jiǎn)便地對(duì)維生素B12富集，固相萃取柱則是根據(jù)固相萃取的類(lèi)型，對(duì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。隨著精密儀器制造技術(shù)的發(fā)展和高分子科學(xué)的進(jìn)步，維生素B12的分析已經(jīng)開(kāi)始從微生物方法逐漸向儀器分析方法轉(zhuǎn)變，隨著前處理的手段不斷進(jìn)步完善，更多儀器分析方法和凈化方法將會(huì)突

36、破檢測(cè)中維生素B12本底值低、樣品雜質(zhì)干擾大的瓶頸，使維生素B12的分析更加高效、準(zhǔn)確。HPLC-UV及HPLC-MS都是新近發(fā)展起來(lái)的分析方法，但目前尚未成為維生素的常規(guī)分析方法。目前還不能在國(guó)內(nèi)的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展。但這些方法能夠?qū)Ψ治鑫镞M(jìn)行準(zhǔn)確定量，從發(fā)展趨勢(shì)上看，它們終將成為維生素分析工作的主流。 參考文獻(xiàn)1 GB10765-2010,食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品S.2 Chen B.High-performance liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrom-etry for simultaneous det

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38、5%DF&skey=%C1%D6%BA%EA%C1%D5&scode=林宏琳,HYPERLINK /kns/popup/knetsearchNew.aspx?sdb=CJFQ&sfield=%D7%F7%D5%DF&skey=%BB%AA%D3%C0%D3%D0&scode=華永有,HYPERLINK /kns/popup/knetsearchNew.aspx?sdb=CJFQ&sfield=%D7%F7%D5%DF&skey=%BB%C6%BA%EA%C4%CF&scode=黃宏南.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中維生素B12 J.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2011,23(5):432-436.6

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40、A2%D0%A1%BE%FC&scode=儲(chǔ)小軍,HYPERLINK /kns/popup/knetsearchNew.aspx?sdb=CJFQ&sfield=%D7%F7%D5%DF&skey=%CC%D5%B1%A3%BB%AA&scode=陶保華,HYPERLINK /kns/popup/knetsearchNew.aspx?sdb=CJFQ&sfield=%D7%F7%D5%DF&skey=%C0%B5%CA%C0%D4%C6&scode=賴(lài)世云等.固相萃取一二維液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方食品中的維生素B12J.浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2013,39(2):185-190.8 楊祖英.食品安全檢

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42、,HYPERLINK /kns/popup/knetsearchNew.aspx?sdb=CJFQ&sfield=%D7%F7%D5%DF&skey=%D0%ED%C8%D9%C4%EA&scode=許榮年,HYPERLINK /kns/popup/knetsearchNew.aspx?sdb=CJFQ&sfield=%D7%F7%D5%DF&skey=%CD%F4%C7%EC%C6%EC&scode=汪慶旗等.超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的維生素B12 J .食品工業(yè),2011,08:103-105.11 崔明,楊大進(jìn),魯杰等.維生素B12檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展J .食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(5):166-171.12 Qiu C., Yun k. Z., Shu Q.W., et