1、實(shí)驗(yàn):大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩苽浜捅４娲竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法掌握轉(zhuǎn)化的方法技術(shù)了解轉(zhuǎn)化過程中各因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響實(shí)驗(yàn)背景簡介重組蛋白為什么表達(dá)量不高或不表達(dá)？重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的分子量為什么偏?。坑行┐竽c桿菌表達(dá)重組蛋白為什么沒有活性？總是形成包涵體？基因表達(dá)體系 1. 原核體系2. 真核體系 pJLA50X系列; pcDNAII; etcpET系列 (T7 promoter, Novagen公司)pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司)pMAL系列 (周質(zhì)表達(dá), BioLabs公司)pGEX系列 (GST融合表達(dá), Pharmacia公司)pBAD

2、系列 (Arabinose誘導(dǎo)型)常用表達(dá)載體pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 限制性缺陷型重組整合缺陷型用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-） 防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外 具有較高的轉(zhuǎn)化效率具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型感染寄生缺陷型大腸桿菌 (Escherichia coli)遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高；基本不分泌，易形成包含體(無正確折疊的立體結(jié)構(gòu))，無加糖等修飾枯草桿菌 (Bacillus subtilis)分泌蛋白質(zhì)能力強(qiáng)

3、，一般有天然立體結(jié)構(gòu)；無加糖修飾功能，培養(yǎng)液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶的水解；質(zhì)粒不穩(wěn)定大腸桿菌常用克隆菌株JM109HB101DH5aXLblueTG1C600外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）及重組整合缺陷型（recA-） BL21(DE3)/pLysS : 自身表達(dá)T7 RNA polymerase 適用pET系列等帶T7啟動(dòng)子的載體M15/SG13009 : 自身表達(dá)T5 RNA polymerase 適用pQE系列等帶T5啟動(dòng)子的載體BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突變 Origami : thioredo

4、xin reductase/glutathione reductase 雙突變 適合帶thioredoxin reductase的融合表達(dá)載體, 幫助形成正確的二硫鍵BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表達(dá)BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表達(dá)Rosetta-gami ：識(shí)別稀有密碼和正確折疊特殊的表達(dá)用菌株體系選擇研究基因功能: 大腸桿菌, 裂殖酵母,昆蟲細(xì)胞, CHO細(xì)胞多肽藥物生產(chǎn): 大腸桿菌, 畢氏酵母, CHO細(xì)胞, 乳腺組織疫苗: 大腸桿菌, 酵母, 單抗生產(chǎn): 雜交瘤細(xì)胞工業(yè)酶生產(chǎn): 各種微生物 受體菌與質(zhì)粒的選擇受體菌： E.Co

5、li DH5：無Ap抗性外源質(zhì)粒 Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力選擇: 如進(jìn)行藍(lán)白斑篩選時(shí)可選用DH5 、JM109 、 TG1 ； 用T7啟動(dòng)子進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)可選用BL21(DE3)；0感受態(tài)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理定義感受態(tài)（Competence)：細(xì)菌處于容易吸 收外源DNA的狀態(tài)轉(zhuǎn)化（transformation)：異源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程致敏過程: 用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作細(xì)菌產(chǎn)生感受態(tài)的類型自然轉(zhuǎn)化（natural transformation） 在生長周期的任何時(shí)刻自動(dòng)產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g. 枯草桿菌）工程

6、轉(zhuǎn)化（engineered transformation） 在生長周期的特定時(shí)刻產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g .大腸桿菌）感受態(tài)細(xì)胞形成的兩種假說1、局部原生質(zhì)體化假說細(xì)胞表面的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，使DNA 分子能通過質(zhì)膜進(jìn)細(xì)胞。2、酶受體假說感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受DNA 的酶 位點(diǎn)，使DNA分子能進(jìn)入細(xì)胞。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的原理 大腸桿菌自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，通常先采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，代表性的方法之一是Ca2+誘導(dǎo)法。感受態(tài)形成后，細(xì)胞生理狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)和酶，負(fù)責(zé)供體DNA

7、 的結(jié)合和加工等。細(xì)胞表面正電荷增加，通透性增加，形成能接受外來的DNA 分子的受體位點(diǎn)等。 Ca2+誘導(dǎo)DNA對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：在0的Cacl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時(shí)Cacl2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。 該法重復(fù)性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)這種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)

8、化，每g質(zhì)粒DNA可以獲得51062l07個(gè)轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要。 制備感受態(tài)細(xì)胞方法原生質(zhì)體法電擊法特殊試劑誘導(dǎo)法：CaCl2誘導(dǎo)法可能的轉(zhuǎn)化機(jī)制分子轉(zhuǎn)化過程分以下幾步: 吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面； 轉(zhuǎn)入雙鏈分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)外源質(zhì)粒分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈； 表達(dá)供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，分裂， 轉(zhuǎn)錄翻譯。重組子的篩選這和受體菌：質(zhì)粒的選擇相關(guān)， 原則上要注意： 受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株； 根據(jù)質(zhì)?；蛐秃褪荏w菌基因型互補(bǔ)原則而定。重組子的篩選方法常用的有兩種方法： 抗生素篩選法 互補(bǔ)法抗生素篩選法菌株為某種抗生缺陷型， 而

9、質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。本實(shí)驗(yàn)利用抗生篩選轉(zhuǎn)化子?；パa(bǔ)法許多載體都具有一段大腸桿菌半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lac Z基因。Lac Z基因編碼的肽鏈?zhǔn)前肴樘擒彰傅陌被说亩唐危?46個(gè)氨基酸）。宿主細(xì)菌帶有-半乳糖苷酶C 端部分序列。宿主細(xì)菌和質(zhì)粒編碼的片段各自都不具有酶活性，但它們可以通過片段互補(bǔ)的機(jī)制形成具有功能活性的半乳糖苷酶分子。Lac Z基因編碼的肽鏈與失去了正常氨基端的半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，這種現(xiàn)象稱為互補(bǔ)。 -互補(bǔ)影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長狀態(tài)：大腸桿菌在對(duì)數(shù)中期易產(chǎn)生感受態(tài) OD值：0.30

10、.5 (5X107個(gè)/ml)試劑的質(zhì)量： 化合物及無機(jī)離子：Rb+、Mn+、二甲亞砜等質(zhì)粒：大小、構(gòu)型外源DNA（質(zhì)粒）與細(xì)胞的比例：器皿的潔凈度污染盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺(tái)中進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的保存 制備好的感受態(tài)細(xì)胞每100uL分裝一支EP管 輕輕混勻-可以用tip頭輕輕攪勻. 4保存（不加甘油），可保存一周； 加30%甘油，-20 保存，可保存一月； 加30%甘油， -80 保存，可保存六月；實(shí)驗(yàn)器材搖床分光光度計(jì)冷凍離心機(jī)超凈工作臺(tái)恒溫水浴涂布棒恒溫培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)試劑LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基氨芐青霉素0.1 M CaCl230% 甘油實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)操作步驟1.挑取一DH5單菌落于2

11、.5ml LB培養(yǎng)液中37過夜培養(yǎng)2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培養(yǎng)液的錐形瓶中，37振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.5-0.6之間3. 取1.5ml菌液置于離心管內(nèi)，4 4500g離心5分鐘每組制備2管感受態(tài)菌！4. 加入1ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，搖蕩重懸細(xì)胞，冰浴30分鐘5. 4 4500g離心5分鐘收集細(xì)胞后，加0.1ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。6.感受態(tài)細(xì)胞分裝成100l的小份,暫且不用的貯存于-70可保存半年。 取其中一份進(jìn)行轉(zhuǎn)化。7. 取50ul感受態(tài)菌入轉(zhuǎn)化管中并加入DNA（不超過1ul）,輕度

12、搖晃混合后于冰上放置10分鐘。8. 將上述混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)熱到42的水浴鍋中，熱休克90秒 (不要搖動(dòng)試管)，然后將試管迅速轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻12分鐘。9. 向管內(nèi)加入950ul的LB培養(yǎng)液。然后37 200rpm 搖床培養(yǎng)30分鐘。10. 取適量體積的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素的LB固體平板上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置幾分鐘11. 倒置平板于37 培養(yǎng)1216個(gè)小時(shí)。每組做質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化： 每50L感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入2L質(zhì)粒DNA,輕輕搖勻，同時(shí)設(shè)置三組對(duì)照：(1)不加質(zhì)粒，(2)不加受體菌， (3)加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒DNA，具體操作按下表進(jìn)行：在轉(zhuǎn)化菌復(fù)蘇時(shí)制備四塊LB瓊

13、脂平板，其中一塊不加Amp,另三塊加Amp,并作好標(biāo)記編號(hào)組 別質(zhì)粒DNA/L水 / L平皿抗性受體菌/ L1受體菌對(duì)照2502受體菌對(duì)照2Amp(15ul)503質(zhì)粒2（ 0.05 g）Amp(15ul)504質(zhì)粒2（ 0.05 g）Amp(15ul)50實(shí)驗(yàn)流程1、接單菌落到5ml LB液體培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜2、5%（250 ul) 菌液接種到含5 ml LB的試管中， 370C振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)，至OD600 0.4-0.5 （已完成）3、將1.5mL菌液轉(zhuǎn)移到離心管中4、離心 5000rpm ，40C，5min5、倒出培養(yǎng)液6. 用冰預(yù)冷的1mL0.1M的Ca

14、Cl2 處理、懸浮細(xì) 胞，7 . 冰上20min8. 5000rpm離心5min，傾去上清9. 100uL CaCl2輕輕懸浮，冰浴大腸桿菌DH5感受態(tài)的制備實(shí)驗(yàn)流程大腸桿菌DH5受態(tài)的制備-1 ml-20 min實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1.實(shí)驗(yàn)樣品: 吸取50uL 感受態(tài)細(xì)胞到另一個(gè)1.5 ml EP管中，加入1uL 質(zhì)粒（槍頭輕輕混勻，勿吹 打） 2.陰性對(duì)照： DH5 感受態(tài)細(xì)胞50uL+1uL無菌水冰浴20mins42 90秒（靜置，勿搖動(dòng)）迅速放到冰上,冰浴2mins加入950uL LB培養(yǎng)基，標(biāo)明組號(hào)，37 200rpm 搖床培養(yǎng) 45 mins 制備LB瓊脂平板(自己制備) 含Ap的L

15、B固體培養(yǎng)基倒平板. 不含Ap的LB固體培養(yǎng)基平板。涂布 實(shí)驗(yàn)樣品和陰性對(duì)照,各100uL涂布于Ap+平板，。 陰性對(duì)照100uL ：涂布于Ap-平板。 培養(yǎng) 靜置15mins, 倒置平板37 培養(yǎng)過夜 轉(zhuǎn)化率計(jì)算 轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算 ： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積） 轉(zhuǎn)化效率（每微克質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù)） 轉(zhuǎn)化子總數(shù)（個(gè)轉(zhuǎn)化子）/加入質(zhì)粒DNA的量（g） 含Ap的LB固體培養(yǎng)基倒平板. 不含Ap的LB固體培養(yǎng)基平板。涂布實(shí)驗(yàn)樣品和陰性對(duì)照,各100uL涂布于Ap+平板，。 陰性對(duì)照100uL ：涂布于Ap-平板。制備LB瓊脂平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)：無菌操作低溫操作觀察

16、結(jié)果（明天上午）預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 平板上出若干單菌落，說明？ 平板上沒有可見菌落，說明？ 平板上出現(xiàn)大量菌落，說明？計(jì)數(shù)單菌落,計(jì)算轉(zhuǎn)化率. 如陰性對(duì)照中長出菌，可能原因是什么？ 菌的密度過高或培養(yǎng)時(shí)間過長時(shí) 會(huì)在陽性菌的周圍長出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是非Amp抗性的，試分析原因。思考題 1、何謂感受態(tài)細(xì)胞？制備感受態(tài)細(xì)胞的理論依據(jù)是什么？ 2、為什么通常使用R-M-菌作為基因工程受體菌？ 3、簡述CaCl2制備細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞及其轉(zhuǎn)化的基本原理。涂布棒的使用 酒精燈的使用 使用前，浸入75%酒精中； 在酒精燈上引燃涂布棒上的酒精（不要燒到手）； 等酒精燒完后，讓涂布棒在空氣中冷卻； 涂布均勻； 將涂布棒重新除菌以備下一次使用。什么是藍(lán)/白斑篩選，怎么進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選？重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法。由互補(bǔ)而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）顯