1、薄層分析、酶抑制技術(shù)和熒光技術(shù)薄層分析、酶抑制技術(shù)和熒光技術(shù)都是基于薄層展開(kāi)后用不同的現(xiàn)色方法進(jìn)行顯色分析的技術(shù)。其中薄層的制備、展開(kāi)和顯色技術(shù)是該分析方法的基礎(chǔ)。第1頁(yè)，共65頁(yè)。薄層技術(shù)薄層色譜法是把固定相（活性吸附劑或鍵合劑）均勻的鋪在一塊平整的板上，制成薄板。厚度約0.25mm。與紙上色譜法一樣，點(diǎn)樣經(jīng)展開(kāi)劑展開(kāi)。特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、效果比紙上色譜法要好。顯色后斑點(diǎn)集中并且可以定量分析（與薄層掃描儀配套）。試樣量少，幾微克到幾百微克?？梢詾楦咝б合嗌V選擇合適的固定相。第2頁(yè)，共65頁(yè)。近代薄層色譜發(fā)展的類(lèi)別簡(jiǎn)介薄層板法（略）圓筒色譜（管狀色譜）法 將固定相涂漬在管的外壁上，可以減少橫向擴(kuò)

2、散，宜于制備色譜用。如果為小孔徑管就為色譜棒。錐形薄層色譜法 將薄層板制作成倒圓錐體。展開(kāi)時(shí)可以使溶劑前沿?cái)U(kuò)大，展開(kāi)劑向前沿?cái)U(kuò)散時(shí)形成速度梯度，結(jié)果抵消了譜帶擴(kuò)展，使試樣再度濃縮。 第3頁(yè)，共65頁(yè)。徑向薄層色譜法兩種類(lèi)型：一種與圓形紙上色譜方法相似，分離效果可以提高1.5倍；另一種是將普通薄層板點(diǎn)樣處固定相刮去，使展開(kāi)劑只能通過(guò)點(diǎn)樣處狹窄部分向前方弧形展開(kāi)。連續(xù)展開(kāi)法在密閉槽中進(jìn)行上行展開(kāi)，展開(kāi)劑移動(dòng)一定距離后即終了。頂板蒸發(fā)展開(kāi)用蓋帶有槽孔的展開(kāi)槽，使部分薄層板露出槽外。展開(kāi)時(shí)，槽里的展開(kāi)劑不能蒸發(fā)，當(dāng)上升到槽外時(shí)就蒸發(fā)。這種展開(kāi)法能夠縮短展開(kāi)劑移動(dòng)滿的斑點(diǎn)之間的距離，不能夠提高分離效能。

3、 第4頁(yè)，共65頁(yè)。開(kāi)口槽展開(kāi)法薄層板在沒(méi)有上蓋的展開(kāi)槽中展開(kāi)。展開(kāi)過(guò)程中展開(kāi)劑隨時(shí)可以蒸發(fā)。越往上蒸發(fā)越快。當(dāng)展開(kāi)劑到達(dá)一定高度時(shí)，上行展開(kāi)劑與蒸發(fā)展開(kāi)劑速率相等，此時(shí)形成了負(fù)的速度梯度，提高了移動(dòng)慢的組分的分離度，而降低了移動(dòng)快的組分的分離度。第5頁(yè)，共65頁(yè)。熱板展開(kāi)法在薄層板的背面用熱塊加熱。在高分離度區(qū)域加熱，形成溶劑速度梯度和溶劑極性梯度，從而改善分離度并可使斑點(diǎn)高度濃縮，提高痕量組分的檢測(cè)靈敏度。連續(xù)展開(kāi)是分離結(jié)構(gòu)相似的多組分的有效方法。為了防止蒸發(fā)時(shí)色譜條件受槽外條件影響和展開(kāi)劑污染空氣，可以用在薄板頂端加吸附劑（多層濾紙）吸附展開(kāi)劑的方法。第6頁(yè)，共65頁(yè)。梯度展開(kāi)法與雙向展

4、開(kāi)法梯度展開(kāi)法展開(kāi)過(guò)程中不斷按照一定比例改變展開(kāi)劑中溶劑的組成。這種方法有時(shí)能夠提高分離效果，特別是反相薄層色譜中常用。雙向展開(kāi)法將試樣點(diǎn)在薄層板的一角，先沿一個(gè)方向展開(kāi)。取出薄層板，干燥后旋轉(zhuǎn)90 o，然后再用同一種展開(kāi)劑或換另一種展開(kāi)劑沿另一方向展開(kāi)。使前一次展開(kāi)后的重疊斑點(diǎn)得以分離。第7頁(yè)，共65頁(yè)。雙向展開(kāi)法特點(diǎn)雙向展開(kāi)法還可以用以檢測(cè)對(duì)光、熱、酸、堿不穩(wěn)定的組分。試樣斑點(diǎn)經(jīng)第一次展開(kāi)后用光照或加熱或用酸堿處理，旋轉(zhuǎn)90 o，再用相同的展開(kāi)劑在相同條件下展開(kāi)，凡是在對(duì)角線上的斑點(diǎn)都是穩(wěn)定的，凡是不在對(duì)角線上的點(diǎn)都是分解產(chǎn)物或反應(yīng)產(chǎn)物。 第8頁(yè)，共65頁(yè)。多次展開(kāi)法試樣經(jīng)一次展開(kāi)不能的到

5、很好的分離結(jié)果時(shí)，是薄層板上的溶劑揮發(fā)后重新用展開(kāi)劑展開(kāi)。如此反復(fù)多次，直到有滿意分離結(jié)果為止。第9頁(yè)，共65頁(yè)。單向或雙向多次展開(kāi)同一種展開(kāi)劑單向或雙向多次展開(kāi)，反復(fù)展開(kāi)時(shí)由于后沿比前沿移動(dòng)快，可以使散開(kāi)的斑點(diǎn)合攏，提高檢測(cè)靈敏度。用兩種或兩種以上不同的展開(kāi)劑分別進(jìn)行多次展開(kāi)，可以將不同的的組分分開(kāi)，稱(chēng)為階梯式展開(kāi)或多極展開(kāi)。 第10頁(yè)，共65頁(yè)。薄層色譜分析方法薄層色譜主要用于定性分析，重要的指標(biāo)是Rf i 。 Rf i=xi /Y Xi：溶質(zhì)i從點(diǎn)樣點(diǎn)所行距離；Y：溶劑所行距離Rf影響因素：溶劑極性，吸附劑活度，薄層厚度，層析缸中溶劑蒸汽飽和度，空氣濕度。 固相選擇：如前所述。操作：制板

6、、晾干、活化、點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色 （計(jì)算Rf）第11頁(yè)，共65頁(yè)。溶劑（展開(kāi)劑）選擇溶劑（展開(kāi)劑）選擇：略。一般情況下用用混合溶劑劑調(diào)節(jié)極性。弱極性溶劑：石油醚、烴、鹵烴中等極性：乙醚、丙酮、醇，強(qiáng)極性 ： 水，吡啶 酸商品農(nóng)藥和已知種類(lèi)的殘留農(nóng)藥一般都選定了薄層條件。第12頁(yè)，共65頁(yè)。25種常見(jiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥展開(kāi)系統(tǒng) 吸附劑/展開(kāi)劑1.硅膠/：甲苯2.硅膠/乙酸乙酯與CH2Cl2(1:1)3.硅膠/己烷丙酮（4：1）4.聚酰胺/己烷丙酮（4：1）5.聚酰胺/己烷醋酸（19：1）6.聚酰胺/甲醇水（1：1）7.聚酰胺/乙醇水氨水（4：4：2）第13頁(yè)，共65頁(yè)。聚酰胺薄板制備與展開(kāi)實(shí)例1g吸附劑加

7、入50mL帶磨口塞的三角瓶中，再依次加入2mL甲醇、1mLCHCl3和2mL乙酸乙酯。每加一種溶劑充分振搖，使十分均勻。取待涂片放在大玻璃片上，排一條。兩邊放等厚玻片下墊厚片（厚度與薄層同）將漿倒在裝好的玻璃片上，用玻璃棒推均勻。通風(fēng)干燥后可用。展開(kāi)注意事項(xiàng)（色譜過(guò)程）點(diǎn)樣后一定要使溶劑揮發(fā)至干；缸內(nèi)蒸汽一定要飽和，二次展開(kāi)一定要將薄板晾干后再展開(kāi)。第14頁(yè)，共65頁(yè)。薄層分析的顯色的一般要求顯色要求顯色，少干擾或易排除物質(zhì)組成恒定，符合一定化學(xué)式，待測(cè)物含量與色斑大小、的深淺有定量靈敏度好高，檢出限量足夠小。有色物要足夠穩(wěn)定顯色條件顯色盡可能完成，可以加入過(guò)量顯色劑酸度調(diào)節(jié)適宜溫度顯色時(shí)間要

8、求短第15頁(yè)，共65頁(yè)。幾種顯色記劑及顯色方法顯色：不同顯色劑有不同顯色法 色譜分析關(guān)鍵措施之一是顯色顯色劑 被顯色物質(zhì) 顯 色 方 法 色 斑AgNO3/NH3 有機(jī)Cl.Br 1.0ml1MagNO3+5mol/L NH3丙酮185ml。 灰或棕 日光或紫外光照5minPdCl2 含硫有機(jī)物 0.1gPdCl2+1MH2SO4 5ml.溶解后+100ml H2O. 黃色 I2 多數(shù)農(nóng)藥 加熱固體碘，使汽化 熏薄板510min。 黃色 熒光硅膠 有紫外吸收農(nóng)藥 GF254. HF254制版， 展開(kāi)后揮發(fā)干溶劑， 紫外照射下觀察 紫色斑第16頁(yè)，共65頁(yè)。AgNO3顯色方法應(yīng)用實(shí)例亦有涂板時(shí)將

9、AgNO3深入吸附劑內(nèi)。方法1：0.1 g AgNO3溶于20mL苯氧乙醇，加丙酮至200mL,加3%H2O2于暗處保存。噴到板上后紫外照10min。淺棕色背景上有紫斑。檢出限量0.05ug0.1ug。方法2：0.17g AgNO3+1mLH2O+5mL濃NH3H2O使用方法及色斑同上，檢出極限0.05ug0.1ug第17頁(yè)，共65頁(yè)。AgNO3顯色方法與原理方法3：1g AgNO3+1mL水+95%乙醇至100mL，噴薄板。檢出極限0.05ug。顯色原理：農(nóng)藥中的-x與Ag+在吸附表面，紫外照射下生成Ag3 Cl2AgClnAg2Cl和AgClO,Ag ;Ag2O,AgCl苯氧乙醇作用：加速

10、AgNO3 與R-X的反應(yīng)。H2O2防背景過(guò)深，紫外加速AgCl分解，亦可加速農(nóng)藥分解，故可以先照薄板10-15min后再?lài)夾gNO3，再照2-3min。此法特點(diǎn)是顯色快，防背景變黑。NH3水和苯氧乙醇同用效果更好第18頁(yè)，共65頁(yè)。芳香胺顯色法六種芳胺可以用于薄層顯色： N，N-二甲苯胺、 對(duì)苯二胺、 聯(lián)苯胺、 聯(lián)（鄰甲苯胺）、 二苯胺、 乙基苯胺。在硅膠板上噴10%聯(lián)苯胺/丙酮后 經(jīng)日光或紫外照射顯色。芳香胺顯色其不足之處是靈敏度不高，色調(diào)不穩(wěn)，只作定性或半定量分析。第19頁(yè)，共65頁(yè)。芳胺顯色的結(jié)果農(nóng) 藥種類(lèi)檢出限量/g0.020.20.22.52.5 10DDE無(wú)色淺土黃深土黃DDT黃

11、色綠黃葉綠DDD無(wú)色弱棕明棕林丹淺藍(lán)鮮藍(lán)深藍(lán)第20頁(yè)，共65頁(yè)。芳胺顯色的結(jié)果農(nóng) 藥種類(lèi)檢出限量/g 0.020.20.22.52.510艾氏劑無(wú)色極弱黃綠淺黃綠異狄氏劑無(wú)色極弱粉紅粉紅六六六極淺藍(lán)鮮藍(lán)深藍(lán)克菌丹極淺酒瓶綠鮮酒瓶綠深酒瓶綠第21頁(yè)，共65頁(yè)。一般顯色劑的不足一般顯色劑對(duì)同類(lèi)農(nóng)藥缺乏選擇性。例：硫代磷酸酯用pH（剛果紅）指示劑顯色機(jī)理是硫元素被氧化劑氧化成硫酸或水解成硫代磷酸而顯色。顯色靈敏性 二硫代硫醇型硫酮型不含硫的農(nóng)藥不顯色第22頁(yè)，共65頁(yè)。常用PH指示劑顯色種類(lèi)及顏色剛果紅； 3.0（藍(lán)） 5.2（紅）溴酚藍(lán)： 3.1（黃）4.6（藍(lán)）溴甲酚綠：4.0（黃）5.6（藍(lán))

12、第23頁(yè)，共65頁(yè)。4-對(duì)硝基芐基吡啶作顯色劑4-對(duì)硝基芐基吡啶是靈敏的烴化劑在一定PH條件下顯色。其顯色機(jī)理如下： 蘭色第24頁(yè)，共65頁(yè)。其它顯色法四乙撐五胺或嗎啉在控制一定酸度下使平衡向有色物方向移動(dòng)。HgNO3(亞汞)-NH3顯色法中，含硫有機(jī)水解成活性S， 生成HgS和Hg，顯黑斑，顯色中輔助試劑不可少第25頁(yè)，共65頁(yè)。常見(jiàn)薄層顯色法靈敏度及其范圍指示劑斑點(diǎn)底色檢出限量（ ug ）農(nóng)藥種類(lèi)檸檬酸/硝酸亞汞/氨黑色淺灰0.020.03含S的磷酸酯苯氧乙醇/硝酸銀/氨黑色淺灰0.020.1有機(jī)氯二苯胺/氯化鋅綠/橙/紫藍(lán)520有機(jī)氯磷酸酯第26頁(yè)，共65頁(yè)。常見(jiàn)薄層顯色法靈敏度及其范圍

13、指示劑斑點(diǎn)底色檢出限量（ ug ）農(nóng)藥種類(lèi)溴/剛果紅藍(lán)紅0.20.5含S的磷酸酯NBP四乙撐五胺藍(lán)白0.20.5磷酸酯（二嗪紅色）溴/溴酚藍(lán)黃藍(lán)0.10.5含S的磷酸酯四溴苯酚磺酸乙酯/硝酸銀藍(lán)紫黃0.051.0含S的磷酸酯第27頁(yè)，共65頁(yè)。常見(jiàn)薄層顯色法靈敏度及其范圍指示劑斑點(diǎn)底色檢出限量（ ug ）農(nóng)藥鄰聯(lián)苯胺/碘化鉀黃綠藍(lán)白0.20.5有機(jī)氯、有機(jī)氟 對(duì)硝基偶氮氟硼酸鹽藍(lán)紫橙0.0110磷酸酯/氨基甲酸酯 雙硫腙黃紅淺綠0.02有機(jī)汞二氯化鈀藍(lán)/黃/褐白0. 53.0含S、P氯的酯類(lèi)化合物第28頁(yè)，共65頁(yè)。常見(jiàn)薄層顯色法靈敏度及其范圍指示劑斑點(diǎn)底色檢出限量（ ug ）農(nóng)藥N2，6 二

14、氯對(duì)苯并醌亞胺 藍(lán)無(wú) 微克級(jí) 氨基甲酸酯 氨基安替比林/鐵氰化鉀 紅紫/黃 微克級(jí)氨基甲酸酯 磷酸/鞣酸/丙酮 洋紅無(wú) 1.0 天然除蟲(chóng)菊酯其它顯色劑：碘蒸汽；硝酸銀/溴甲酚綠；氯亞明丁；亮綠；孔雀綠；二氯醌亞胺；鄰聯(lián)二茴香胺；靛紅/硫酸等顯色劑（法）。第29頁(yè)，共65頁(yè)。薄層-酶抑制技術(shù)薄層-酶抑制技術(shù)是薄層顯色技術(shù)的特殊方法。特點(diǎn)：靈敏度高，適應(yīng)性廣，可以檢出化學(xué)顯色檢不出的物質(zhì)顯色原理：有機(jī)磷與氨基甲酸酯農(nóng)藥對(duì)輔乳動(dòng)物毒性在于抑制中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)膽堿酯酶。膽堿酯酶分解乙酰膽堿和醋酸，其它酯類(lèi)也會(huì)水解成顯色物質(zhì)。而農(nóng)藥所在之處，由于膽堿酯酶被抑止則基質(zhì)物質(zhì)不能水解顯色，所以在有色背景上出

15、現(xiàn)無(wú)色斑點(diǎn)。故酶抑制技術(shù)實(shí)際上是酶水解基質(zhì)顯色而非農(nóng)藥顯色。第30頁(yè)，共65頁(yè)。酶種來(lái)源1、 動(dòng)物肝臟酯酶2、 人血漿或血清3、 馬血清或黃鱔膽堿酯酶4、 蜜蜂或蠅頭的腦酯酶5、 牛胰腺酵素或酸性磷酸酯酶6、 動(dòng)物羧酸酯酶第31頁(yè)，共65頁(yè)。酶基質(zhì)各種乙酰膽堿、乙酸萘酯、羧酸酯、乙酰羥基吲哚等1、 乙酸羥基吲哚及其衍生物2、 乙酸-萘酯及其衍生物3、 鹵化乙酰膽堿4、 乙酸靛酯5、 磷酸硝基苯酯6、-N-苯甲?；?DL賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽（CBAPNA）只適用于胰酶第32頁(yè)，共65頁(yè)。 乙酰膽堿-溴百里酚藍(lán)顯色法顯色原理：乙酰膽堿被酶分解出膽堿與乙酸，然后用溴百里酚藍(lán)顯色；pH6.2（黃色

16、）7.6（蘭色）。反應(yīng)方程式如下：第33頁(yè)，共65頁(yè)。乙酸-萘酯固藍(lán)B鹽顯色法 酶分解出-萘酚與固藍(lán)鹽B顯紫紅色乙酰羥基吲哚顯色法利用水解產(chǎn)生-羥基吲哚與氧氣產(chǎn)生靛藍(lán)（藍(lán)底白斑）。第34頁(yè)，共65頁(yè)。醋酸靛酯顯色法利用醋酸靛酯水解產(chǎn)生靛酚藍(lán)顯色。 靛酚藍(lán)（蘭色）第35頁(yè)，共65頁(yè)。TCL-EI技術(shù)基質(zhì)顯色情況 酶 機(jī) 質(zhì)斑點(diǎn)底色乙酸-萘酯固藍(lán)B鹽白紫紅吲哚乙酸酯白藍(lán)5溴吲哚乙酸酯白藍(lán)/紫紅5溴6氯吲哚乙酸酯白粉紅乙酰膽堿+溴百里酚藍(lán)藍(lán)黃第36頁(yè)，共65頁(yè)。TCL-EI技術(shù)基質(zhì)顯色情況 酶 機(jī) 質(zhì)斑點(diǎn)底色5溴4氯吲哚乙酸酯白藍(lán)綠吲哚酚 +固藍(lán)RR白粉紅5溴4氯吲哚乙酸酯+固藍(lán)RR白粉紅第37頁(yè)，

17、共65頁(yè)。酶液制備從動(dòng)物肝制取酶液動(dòng)物肝 一份3(去筋膜;脂)加三份蒸餾水,勻漿離心分離,取清液-備用. 用時(shí)5-20倍稀釋。從動(dòng)物血清制取酶液剛抽出馬血,不加抗凝劑練凝，取清液備用。用時(shí)加1-5倍水稀釋(保質(zhì)1年)。將清液加如22% Na2SO4 溶液 (1:22)，于37靜置24小時(shí),去沉降 ,可以延長(zhǎng)儲(chǔ)存期，還可改善斑點(diǎn)模糊的情況。第38頁(yè)，共65頁(yè)。機(jī)質(zhì)及顯色劑基質(zhì)1、乙酸萘脂10mg 溶于5-6 mL無(wú)水乙醇2、乙酸羥基吲哚15mg溶于5 mL無(wú)水乙醇(或20mg加2mL 無(wú)水乙醇,用時(shí)加8mLPH=9.4的硼酸液混合).3、乙酸靛酯1.5 mg溶于15mL無(wú)水乙醇.顯色劑：20-2

18、5mg固藍(lán)鹽B溶于16mL 蒸餾水1.65gK3Fe(CN)6 +1.84 g K4Fe(CN)6溶于100mL 蒸餾水緩沖溶液： 0.2M三羥甲基氨基甲烷(Tris) 25 mL+20mL0.1MHCl蒸餾水至100mL (pH=8.32).第39頁(yè)，共65頁(yè)。顯色方法展開(kāi)后的薄板,噴酶工作液至濕潤(rùn)狀態(tài),調(diào)恒溫箱溫度37-38 相對(duì)濕度80-90%,酶活化30分鐘,取出噴基質(zhì),數(shù)十分鐘顯色襯斑. 酶液與基質(zhì)液配比酶: 鼠肝酯酶或馬血清工作液, B鹽16mL與酯液6mL 混合乙酸萘酯固鹽B顯色法. 乙酸羥基吲哚牛肝酯酶或馬血清工作液Tris/HCl 4 mL +2mol/LNaCl5mL +1

19、mol/LCaCl2 0.2mL +K3Fe(CN)6 與K4Fe(CN)6 2 mL +蒸餾水13mL+5mL乙酸羥基吲哚或乙酸靛酯混合。第40頁(yè)，共65頁(yè)?；|(zhì)應(yīng)用條件 乙酸5溴羥基吲哚基質(zhì)動(dòng)物肝酶與 Tris/HCl 1:8稀釋成工作液對(duì)多種氨基甲酸酯農(nóng)藥檢出限量為0.1-10毫微克.乙酸 靛酯基質(zhì)基質(zhì)15mL與K3Fe(CN)6 與K4Fe(CN)6 2 5mL混合 蜜蜂腦酶與 Tris/HCl 1:25混合牛肝酯酶和胰酶素用于TCL-E1檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥,許多酶抑制劑在生物體內(nèi)是弱作用,有時(shí)轉(zhuǎn)化成它們的氧化類(lèi)同物可能有強(qiáng)抑制作用,可能足夠的抑制能力.第41頁(yè)，共65頁(yè)。酶抑制劑轉(zhuǎn)化劑和

20、薄層厚度發(fā)煙HNO3，稀溴/水，溴蒸汽，溴代琥珀酰亞胺(NBS)，雙氧水/乙酸，間氯過(guò)氧苯甲酸，紫外光, 雙氧水/氨。酶抑制劑的薄層比一般薄層厚一些,一般為350-500 毫微米,為酶基質(zhì)提供較充分的支持介質(zhì), 可獲得低色與抑制斑較強(qiáng)的反差。 酶濃度過(guò)大或過(guò)多會(huì)覆蓋抑制部分,會(huì)使斑點(diǎn)被顯色物所蓋.第42頁(yè)，共65頁(yè)。薄層熒光分析技術(shù)熒光產(chǎn)生原理熒光：一個(gè)電子從最低激發(fā)單線態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)射的光子。其放出量子的能量低于吸收量子的能量。薄層原位熒光測(cè)定技術(shù)中以近紫外和可見(jiàn)光作激發(fā)光，熒光側(cè)在可見(jiàn)光區(qū)。農(nóng)藥測(cè)定技術(shù)中可以用以下方法：1、薄 層背景猝滅，斑點(diǎn)熒光；2、背景熒光，斑點(diǎn)猝滅。第43頁(yè)，共65

21、頁(yè)。物質(zhì)結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系一般剛性、平面 芳香結(jié)構(gòu)有利于發(fā)生熒光;給電子基，如-OH、-NH2 傾向于增強(qiáng)熒光.空間張力和吸電子基使熒光 熄滅或減弱，可旋轉(zhuǎn)彎曲的分子有損于受激能量。有些農(nóng)藥分子本身具備熒光特性，有些要經(jīng)過(guò)處理才有熒光。第44頁(yè)，共65頁(yè)。農(nóng)藥預(yù)處理方法本身不產(chǎn)生熒光的農(nóng)藥分子經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)，使之轉(zhuǎn)變成產(chǎn)生熒光的分子。水解使農(nóng)藥生成熒光離子或化合物.。如羥基苯并 吡喃 (蠅毒磷)；含氨基苯甲酸(谷硫磷)。 2-氨基苯并咪唑 (苯萊特)N-羥基萘甲酰胺。西維因及其代謝物水解成萘酚陰離子。第45頁(yè)，共65頁(yè)。配位基基交換產(chǎn)生熒光配位基基交換產(chǎn)生熒光是指農(nóng)藥水解產(chǎn)物與金屬配合物反應(yīng)，交換

22、出金屬鰲合物中可以產(chǎn)生熒光的配體陰離子。如脫葉磷水解產(chǎn)生丁硫醇，丁硫醇可以把8 羥基喹啉磺酸的 鈀 螯合物中的8 羥基喹啉交換出來(lái), 而顯熒光(在氯化鎂存在下)。含硫有機(jī)磷化合物經(jīng)溴活化處理生成溴化氫，溴化氫置換 螯合物中配體而顯熒光。鈣黃綠素金屬鰲合物與某些農(nóng)藥配基交換。第46頁(yè)，共65頁(yè)。影響熒光的因素吸附劑上的溶劑可以顯著影響熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)。極性溶劑比烴類(lèi)溶劑更能增強(qiáng)熒光。如5無(wú)取代的黃酮，在非極性溶劑中無(wú)熒光,而在極性溶劑中強(qiáng)熒光。在薄層上噴上非瑟酮，能在弱熒光或非熒光底板上顯農(nóng)藥光斑。用于氨基甲酸酯極性農(nóng)藥最小檢出限量為10-60微克.第47頁(yè)，共65頁(yè)。PH值和溫度對(duì)熒光的影響PH

23、值改變往往使熒光明顯改變。如含硫有機(jī)物磷農(nóng)藥經(jīng)Br2 處理，產(chǎn)生HBr ，在農(nóng)藥斑點(diǎn)的酸性條件下，噴上DDQ (2，3-二氯-5，6-二氰基對(duì)苯醌)的中性溶液,在農(nóng)藥斑的酸性條件下DDQ強(qiáng)烈發(fā)熒光。熱處理： 某些原有熒光的農(nóng)藥經(jīng)熱處理,使熒光激發(fā)和發(fā)射峰顯著向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。并增加強(qiáng)度，其結(jié)果是使檢出限量更小。如2-（2吡喃）-苯并咪唑 ，在薄層上加熱處理后最小檢出限量從1000微克提高到2微克.第48頁(yè)，共65頁(yè)。熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記是熒光試劑取代無(wú)熒光農(nóng)藥分子中一個(gè)簡(jiǎn)單原子，形成有熒光化合物的過(guò)程。許多含羰基官能團(tuán)的農(nóng)藥,通常用2-（二苯乙酰）-1，3-茚滿二酮-1-腙和2-羥-5-甲氧基苯甲酰

24、肼或5-甲氧基-2-硝基水楊酰肼標(biāo)記。用于標(biāo)記含羰基農(nóng)藥分子的熒光試劑第49頁(yè)，共65頁(yè)。含伯仲叔胺的農(nóng)藥的熒光標(biāo)記經(jīng)還原或水解生成伯仲叔胺的農(nóng)藥一般用DS氯化物，NBD氯化物（4-氯-7-硝基-2-1，3-惡二唑）和熒光胺等標(biāo)記形成了強(qiáng)熒光衍生物。如甲氨基酸脂農(nóng)藥水解產(chǎn)物酚和甲胺,苯胺基甲酰脂和取代脲除草劑產(chǎn)生苯胺等.熒光胺只與伯胺產(chǎn)生衍生物 。標(biāo)記伯、仲、叔胺農(nóng)藥分子的熒光試劑第50頁(yè)，共65頁(yè)。熒光顯色技術(shù)實(shí)例氯化鈀鈣黃葉綠素顯色：農(nóng)藥斑顯色法適用范圍：含硫有機(jī)磷農(nóng)藥原理：在鹽酸介質(zhì)中Pd2+與二硫代或硫代物型磷酸分別形成1:1型或者1：2型螯合物，在白色薄底上現(xiàn)黃褐斑.檢測(cè)出限量為微克

25、級(jí)。加鈣黃綠素和鈣黃綠素藍(lán)，金屬熒光試劑所發(fā)熒光可被副族金屬離子猝滅。猝滅的熒光試劑噴于活性硫的農(nóng)藥斑上。游離出鈣黃綠素，熒光很強(qiáng)，檢出限量可達(dá)10-150毫克級(jí).第51頁(yè)，共65頁(yè)。試劑配制取PdCl2溶于濃鹽酸配成5%的溶液，用0.1MHCl稀釋成0.05mol/L(PdCl2 MW=177.31)。取一定的鈣黃綠素(MW=622.54)，用0.1mol/L NaOH配成0.02M溶液.取兩溶液按一定比例混合,加入數(shù)滴5mol/LNaOH溶液,用0.05mol/L的H3PO4調(diào)至pH=7.2，并稀釋成2.0 10-4 mol/LPd2+和1.6 10-4mol/L鈣黃綠素，或6.010-4

26、 mol/L鈣黃綠素。貯存數(shù)小時(shí)，可保最大猝滅。 臨用前用1:1丙酮和水稀釋成工作液。第52頁(yè)，共65頁(yè)。工作液的濃度要求工作液的濃度要求如下:1.010-4 mol/LPd2+和8.010-5mol/L鈣黃綠素5.010-5mol/LPd2+和4.0 10-5mol/L鈣黃綠素1.010-4mol/LPd2+和3.0 10-4mol/L鈣黃綠素顯色:上述工作液噴展開(kāi)后的薄板呈透明狀, 二硫代磷酸酯干后一小時(shí)可在紫外光下檢出。硫代磷酸酯的薄板放在存飽和硝酸鈣溶液的密閉容器中(相對(duì)濕度57%)18-24小時(shí).或在潔凈的空氣中同樣長(zhǎng)的時(shí)間，用3650nm 照射，粉紅底上出現(xiàn)藍(lán)色熒光。 第53頁(yè)，共

27、65頁(yè)。熒光顯色劑與羅丹明B顯色法不同的熒光物質(zhì)中具有N-甲基和N-乙基者，對(duì)有機(jī)氮顯色快,靈敏度大， Cl-干擾小,如：N，N ， N，N四乙基聯(lián)苯胺；N，N二甲基熒光蒽；N甲基咔唑，3氨基芘；羅丹明B和試鹵靈。第54頁(yè)，共65頁(yè)。羅丹明B溶液的配制取羅丹明B50mg溶于50ml 水作為儲(chǔ)備液。使用時(shí)取儲(chǔ)備液10mL，加于含0.3gKBr和0.6gKOH的80 mL水中，噴于展開(kāi)后的薄板上。置薄板于254350nm下照1030min，趁薄板上有一定溫度時(shí)觀察，紫外背景上有黃紅熒光，而農(nóng)藥斑點(diǎn)處熒光猝滅 。板干后再?lài)姳?水（1：1），熒光再現(xiàn)。此顯色液一天有效。第55頁(yè)，共65頁(yè)。羅丹明顯色

28、(對(duì)有機(jī)氯較靈敏)A溶液： 25 mg羅丹明B溶于于25ml 水中備用。.B溶液：取A溶液5 ml與含0.15 KBr 和0.3g KOH的40 ml水溶液混合得。C溶液： B溶液與丙酮混合液(1:1)顯色:展上噴B液后在250或350nm紫外光 照1-30分鐘，底板紅熒光，斑點(diǎn)猝滅。干后再?lài)奀液，斑點(diǎn)再現(xiàn)。有機(jī)氯農(nóng)藥可檢出至20微克。第56頁(yè)，共65頁(yè)。薄 色譜定量方法簡(jiǎn)介原位斑點(diǎn)定量法有直接法與間接法。直接法：面積、色階、工作曲線。間接法：色譜掃描儀與光密度計(jì)。 溶出定量：與光度計(jì)、光譜、氣譜、液譜、質(zhì)譜、極譜聯(lián)用。稱(chēng)重法: 將色斑標(biāo)記，在Xe 或X復(fù)寫(xiě)機(jī)獲得色譜斑復(fù)本，剪下斑點(diǎn)紙片，在分

29、析天平稱(chēng)重；或把色譜斑吸附劑剝下稱(chēng)重。沿半對(duì)數(shù)紙的橫坐標(biāo)對(duì)農(nóng)藥稱(chēng)量(縱坐標(biāo))作圖，繪制工作曲線以斑點(diǎn)重查典線得樣品農(nóng)藥重.第57頁(yè)，共65頁(yè)。色譜色階比色法 將標(biāo)準(zhǔn)系列與待測(cè)樣的一定量點(diǎn)在同一薄 層板上展開(kāi)顯色。依面積大小，色度深淺概括樣品定量。此法實(shí)際上只是半定量。溶出1法: 將斑點(diǎn)剝離后用溶劑浸出,經(jīng)適當(dāng)處理，配合儀器聯(lián)用。此法實(shí)際上是只用薄 層分離提純。含磷農(nóng)藥浸出后用硫酸/高氯酸變成磷酸。然后與 鉬酸銨作用生成磷 鉬酸。 PO43- + 12MoO42- + 27H+ = H7P（Mo2O7）6 +10H2O磷鉬酸還原成磷鉬酸藍(lán)：H7P（Mo2O7）6 + 2 SnCl2 + 4HCl

30、= H7P（Mo2O7）5 + Mo2O5+ SnCl4 + 2H2O第58頁(yè)，共65頁(yè)。分析過(guò)程 取下有機(jī)磷藥斑于離心試管中，加如少量丙酮或甲酸浸出，離心分離，反復(fù)三次。合并浸取液，揮發(fā)溶劑，加50% 硫酸 6滴，4滴高氨酸。小心加熱至澄清，加1滴酚酞，NaOH中和至微紅，1mol/L的硫酸中和至無(wú)色，得樣品液。稱(chēng)取KH2PO40.4394g，少量蒸餾水溶解后定容至100mL，取10ml 稀釋至100mL，得含磷10g的工作液。加1%的（NH4）2MoO4/1mol/L硫酸3mL， 加水至10mL，搖勻后加一滴 SnCl2/HCl ,再搖勻用650nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度A。如此制作工作曲線,用樣品

31、液照工作液方法處理得A樣,從而查出樣品農(nóng)藥含量（g/ mL） 。 第59頁(yè)，共65頁(yè)。農(nóng)藥含量計(jì)算與影響因素農(nóng)藥含量 = 含磷量 （ g ） k 提取液體積/點(diǎn)樣體積樣重 注意:用農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣代替 KH2PO4時(shí) 誤差較小 反應(yīng)時(shí)的酸度(生成鉬藍(lán)時(shí))0.481.44mol/LH+薄層吸附劑含P有干擾用鹽酸浸泡含吸附劑，反復(fù)漂洗;Fe3+ 與鉬藍(lán)形成混合物，降低吸光度，可以加NaF消除。 SiO32-與鉬酸銨形成黃色 H9Si（Mo2O7）6還原時(shí)也生成硅鉬藍(lán),可以用檸檬酸或酒石酸來(lái)-控制 MoO42濃度從而達(dá)到控制 MoO42-與 SiO32-作用； AsO43-與 MoO42-作用可用Na2SO3除去。第60頁(yè)，共65頁(yè)。斑點(diǎn)面積計(jì)算法:色斑面積計(jì)算法主要是依S.T Purdg原理：A1/2 = m