1、分子標(biāo)記在花生上的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景 作物遺傳育種 周金超 導(dǎo)師：劉立峰Introduction 花生(Arachis hypogaea)(2n=4x=40)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的油料與經(jīng)濟(jì)作物,是20世紀(jì)全球最重要的四大油料作物之一?；ㄉN仁中脂肪和蛋白質(zhì)占80%以上,含有人類必需的8種氨基酸以及脂肪酸亞油酸,另外含有鐵、鈣、鋅等礦質(zhì)元素, 素有“長壽果”之美稱。 Introduction 我國在世界花生生產(chǎn)中占有極為重要的地位, 1993年以來花生總產(chǎn)和消費量穩(wěn)居世界之首?；诨ㄉ趪窠?jīng)濟(jì)和人民生活中所占的重要地位,其遺傳研究一直受到廣泛重視。常規(guī)育種方法存在育種周期長、對目標(biāo)單株的選擇效率

2、低、成本高等難以克服的缺點。利用分子標(biāo)記，可以在DNA 分子水平上科學(xué)地選配育種親本，利用與重要目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記則可以對雜種后代進(jìn)行科學(xué)的選擇。Introduction 花生在形態(tài)、生理、農(nóng)藝性狀等方面存在著豐富的變異，而在DNA分子水平上揭示的多態(tài)性較少。由于花生遺傳背景的復(fù)雜性，DNA多態(tài)性的限制，這個極大的限制了分子標(biāo)記輔助選擇在花生育種上的應(yīng)用。目前花生DNA分子標(biāo)記研究明顯落后于其他作物。因此，篩選花生多態(tài)性標(biāo)記是花生育種的工作重點。 分子標(biāo)記的優(yōu)點 利用分子標(biāo)記, 可以在 DNA 分子水平上科學(xué)地選配育種親本、利用與重要目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記則可以對雜種后代進(jìn)行科學(xué)的選擇,

3、而且不受環(huán)境條件和作物生育期的影響,鑒定結(jié)果穩(wěn)定可靠,具有選擇效率高、準(zhǔn)確性高、成本低等優(yōu)點,可大大縮短育種時間。花生育種中常用的分子標(biāo)記種類 1.基于Southern雜交的分子標(biāo)記 RFLP：restriction fragment length polymorphism 小衛(wèi)星DNA：minisatellite DNA 2.以 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記 RAPD：random amplified polymorphic DNA SSR: simple sequence repeat SCAR： sequence characterized amplified regions

4、 AFLP： amplified fragment length polymorphism SRAP： sequence related amplified polymorphism分子標(biāo)記在花生中的應(yīng)用1.遺傳多樣性的研究2.抗性的研究3.雜交后代的鑒定4.構(gòu)建花生遺傳圖譜5.花生油酸/亞油酸比值( O/ L)的研究 6.構(gòu)建花生指紋圖譜1.遺傳多樣性的研究姜慧芳等利用RAPD 技術(shù)對7個不同植物學(xué)類型的花生種質(zhì)資源進(jìn)行了分析,在所用的83個隨機(jī)引物中,13個引物的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示出不同品種間的多態(tài)性,能顯示花生品種間DNA 多態(tài)性的引物占15.7%,這13個引物共擴(kuò)增出121條DNA帶,其中具

5、多態(tài)性的片段26條,占21.48%。1.遺傳多樣性的研究葉冰瑩等用RAPD技術(shù)分析了12個花生品種的遺傳多樣性,從80個隨機(jī)引物中篩選出20個進(jìn)行擴(kuò)增,共擴(kuò)增出180條帶,其中132條具有多態(tài)性,占73.33%，平均每個引物提供9個RAPD標(biāo)記的信息量。韓柱強(qiáng)等利用11對SSR引物對24個栽培花生種(包括4大類型)進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析,其中4對檢測到明顯的多態(tài)性,共檢測到33個等位基因變異,每一個位點上檢測到的變異數(shù)為513個,平均8.25個,根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果可以將24個品種中的21個相互區(qū)分。1.遺傳多樣性的研究 陳強(qiáng)等對32個來源于中國不同產(chǎn)地的花生品種進(jìn)行了AFLP指紋圖譜及相似性聚類分析。結(jié)

6、果表明: 所有供試花生品種的遺傳相似性為 35%,在45%的相似性水平上分為3個群 表明中國花生品種存在遺傳多態(tài)性。 王傳堂等研究了分屬3個市場型的10個中國花生栽培種的序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性。根據(jù) SRAP 指紋圖譜進(jìn)行聚類分析可將這10個品種分為4類。2.抗性的研究雷永等成功地將AFLP標(biāo)記E45/M53-440轉(zhuǎn)化為實驗結(jié)果穩(wěn)定、操作更簡單的SCAR標(biāo)記AFs-412,標(biāo)記與花生黃曲霉侵染抗性間的遺傳距離為6.5cM。利用獲得的SCAR標(biāo)記對抗、感黃曲霉的花生種質(zhì)資源進(jìn)行了分子鑒定, 結(jié)果表明,標(biāo)記與抗性鑒定結(jié)果具有較高的一致性,證實了該標(biāo)記應(yīng)用于研究群體之外的育種潛力。2.抗性研究 姜惠芳

7、等以抗青枯病花生品種“9102”與感病品種中花5號雜交,通過“單粒傳”法構(gòu)建了青枯病抗性重組近交系群體(RILs),含123個家系。用164對SSR引物鑒定親本DNA多態(tài)性及其最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,獲得能檢測RILs群體多態(tài)性的引物11對及其最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。用能顯示多態(tài)性的引物對RILs F6代群體進(jìn)行檢測, 獲得多態(tài)性標(biāo)記10個。3.雜交后代的鑒定 可以通過分子標(biāo)記來判斷外源基因是否導(dǎo)入到雜交后代中去,僅憑觀察形態(tài)性狀很難準(zhǔn)確判斷并且耗費時間,而且容易受環(huán)境條件的影響。利用分子標(biāo)記技術(shù)就可以比較容易地克服上述問題。4.構(gòu)建花生的遺傳圖譜 Halward 等利用二倍體野生種種間雜A.

8、stenospermaA.cardenasii后代群體,構(gòu)建出花生的RFLP圖譜,該圖譜覆蓋圖距為1400cM,定位了117個RFLP標(biāo)記,分布在11個連鎖群上,編碼與脂肪生物合成有關(guān)酶的基因的3個cDNA克隆已被定位在圖譜上。 5.花生油酸/亞油酸比值( O/ L)的研究 花生油脂品質(zhì)包括營養(yǎng)成分和耐貯藏特性兩個方面?；ㄉ贩N的油酸/亞油酸比值(簡稱O/L比值)是花生及其制品耐貯藏性的重要指標(biāo),O/L比值越高,花生及其制品耐貯藏性越好,貨架壽命越長。5.花生油酸/亞油酸比值( O/ L)的研究 Lpez等從兩個親本T90和F435中,擴(kuò)增出一個3525bp大小的片段,通過高油酸和低油酸序列比

9、較, 發(fā)現(xiàn)幾個單核苷酸的差異(SNPs),兩個變異和高油酸有關(guān),一個是在編碼區(qū)后442bp處插入了一個核苷酸A轉(zhuǎn)換了氨基酸的可讀框。另一個是在448bp處一個核苷酸的變化,導(dǎo)致了一個氨基酸的替換。5.花生油酸/亞油酸比值(O/L)的研究 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)?50位氨基酸為天冬氨酸(D)時,酶活性較高(ahFAD2A),油酸含量低;在ahFAD2B 中,150位為天冬酰胺(N),或用點突變將ahFAD2A中的D變?yōu)镹時,酶活性降低,油酸含量增加。6.構(gòu)建花生指紋圖譜 陳強(qiáng)等對32個來源于中國不同產(chǎn)地的花生品種進(jìn)行了AFLP指紋圖譜及相似性聚類分析。結(jié)果表明: 所有供試花生品種的遺傳相似性為35%,在4

10、5%的相似性水平上分為3個群,表明中國花生品種存在遺傳多態(tài)性。翁躍進(jìn)等利用AFLP技術(shù)對從國際半干旱所(ICRISAT)引進(jìn)的9份花生抗旱品種繪制指紋圖譜, 通過引物 E-ACA 和與之匹配的M-CAG和M-CAT, 在300 6000bp的范圍內(nèi)共獲得1577條AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物, 每個品種有主帶和次帶至少71 條之多, 其中10條為多態(tài)性的帶紋。 利用4 個標(biāo)記的引物擴(kuò)增帶型構(gòu)成19 個品種的特異性指紋, 根據(jù)指紋圖譜的差異使它們相互區(qū)分。本實驗室利用 20 對 SSR引物對75個河北省 不同植物類型花生地方品種遺傳多樣性進(jìn)行分析。共檢測到65個等位基因，品種間不同位點等位基因數(shù)目不等，范圍

11、為 26 個，平均 3.25個，其中以 PM15、PM377 的等位變異數(shù)最多，為 6個。通過計算20對引物在不同品種間的多態(tài)信息指數(shù)和聚類分析將河北省地方品種區(qū)分、歸類。分子標(biāo)記在花生育種上的貢獻(xiàn) In order to develop a genetic linkage map for tetraploid cultivated groundnut, a total of 1,145 simple sequence repeat (SSR)markers were screened on two genotypes, TAG 24 and ICGV 86031 that are paren

12、ts of a recombinant inbred line mapping population. MethodResult 144 (12.6%) polymorphic markers were identied and these amplied a total of 150 loci. A total of 135 SSR loci could be mapped into 22 linkage groups (LGs).Material and method Three recombinant inbred lines (RILs) populations were constr

13、ucted from three crosses with one common female parental line Yueyou 13, a high yielding Spanish market type. The four parents were screened with 1044 primer pairs designed to amplify SSRs and 901 primer pairs produced clear PCR products. Result The composite linkage maps consist of 22 composite lin

14、kage groups (LG) with 175 SSR markers (including 47 SSRs on the published AA genome maps), representing the 20 chromosomes of A. hypogaea. The total composite map length is 885.4 cM, with an average marker density of 5.8 cM. Experiment Purpose The objective of this study was to develop a comparative

15、 integrated map from two cultivated cultivated recombinant inbred line (RIL) mapping populations and to apply in mapping Tomato spotted wilt virus (TSWV) resistance trait in peanut.Result A total of 4,576 simple sequence repeat (SSR) markers were used for screening polymorphisms. A total of 324 markers were anchored on this integrated map covering 1,352.1 cM with 21 l