1、DB37山東省地方標準DB37/T-2018水質(zhì)磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測定液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法Waterquality-DeterminationofantibioticsofSulfonamides,QuinolonesandMacrolidesinwater-Liquidchromatographytriplequadrupolemassspectrometry（征求意見稿）201-口-發(fā)布201-口實施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布 目次TOC o 1-5 h z前言II適用范圍1規(guī)范性引用文件1方法原理1干擾與消除1試劑和材料2儀器和設(shè)備3樣品4分析步驟4結(jié)果計算與表示6

2、精密度和準確度7質(zhì)量保證和質(zhì)量控制8廢物處理9附錄A（規(guī)范性附錄）方法的檢出限和測定下限10附錄B（資料性附錄）液相色譜參考條件11附錄C（資料性附錄）質(zhì)譜參考條件12附錄D（資料性附錄）標準物質(zhì)、替代物及內(nèi)標物質(zhì)MRM譜圖13附錄E（資料性附錄）方法的精密度和準確度17-LX.1冃IJ言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B、附錄C、附錄D、附錄E為資料性附錄。本標準由山東省環(huán)保標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：山東省環(huán)境監(jiān)測中心站。本標準驗證單位：濟南市環(huán)境監(jiān)測中心站、泰安市環(huán)境保護監(jiān)測站、山東省分析測試中心、山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院、青島譜

3、尼測試有限公司、青島市華測檢測技術(shù)有限公司。本標準主要起草人：郭文建、張慧、朱晨、王桂勛、岳太星、李紅莉、丁波濤。本標準為首次發(fā)布。本標準由山東省環(huán)境保護廳提出并負責解釋。水質(zhì)磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測定液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法警告：實驗中使用的溶劑和試劑均具有一定的毒性，對健康具有潛在的危害，應(yīng)盡量避免與這些化學品的直接接觸。樣品制備過程應(yīng)在通風櫥中進行，操作時應(yīng)按規(guī)定要求佩戴防護器具；所用試劑及分析后的樣品需回收并進行安全處理。適用范圍本標準規(guī)定了測定水中12種磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法。本標準適用于地表水、地下水和廢水中磺胺間甲氧嘧啶、磺

4、胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶；諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟羅沙星；脫水紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素的定性和定量檢測。當富集水樣體積為500ml,濃縮后定容體積為1.0ml,進樣體積為20“時，固相萃取的方法檢出限范圍為0.7ng/L6.9ng/L,測定下限范圍為2.8ng/L27.6ng/L，詳見附錄A。規(guī)范性引用文件本標準內(nèi)容引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件,其有效版本適用于本標準。HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ/T164地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范方法原理水樣調(diào)節(jié)pH為2.04.0左右,經(jīng)濾膜過濾除去顆粒物,水樣中的抗生素類化合物經(jīng)固相萃取柱富集

5、凈化,采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法分離檢測。采用電噴霧正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式，根據(jù)目標化合物的保留時間和特征離子峰定性，內(nèi)標法定量。干擾與消除在本方法規(guī)定的條件下，為防止金屬離子與抗生素結(jié)合形成絡(luò)合物，干擾固相萃取過程，降低此類化合物的提取效率。可向水樣中加入乙二胺四乙酸四鈉，抑制金屬離子的干擾。水中余氯等其他具有氧化性的有機物會干擾磺胺類抗生素的測定，可向水中（按0.5L計）加入150mg抗壞血酸去除干擾。試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水為新制備的不含目標化合物的純水。鹽酸：P（HC1）=1.189g/ml,分析純。硫酸：P（H2SO

6、4）=1.84g/m,分析純。乙腈（CH3CN），色譜純。甲醇（CH3OH），色譜純。甲酸（HCOOH）：色譜純。5.6乙二胺四乙酸四鈉（Na4EDTA），分析純。5.7抗壞血酸（C6H8O6）。6865.8鹽酸溶液：量取50ml鹽酸（5.1），緩慢加入到純水中，待溫度降至室溫后，用純水定容到100ml。5.9硫酸溶液：c（H2SO4）=4.0mol/L。量取22ml硫酸（5.2），緩慢加入到純水中，待溫度降至室溫后，用純水定容到100ml。pH=2.0去離子水：用鹽酸（5.8）溶液調(diào)節(jié)去離子水至pH=2.0。0.1%甲酸去離子水溶液：量取0.5ml甲酸（5.5），緩慢加入到純水中，待溫度降至

7、室溫后，用純水定容到500ml。甲醇/乙腈混合溶液：1+1。0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液：量取0.5ml甲酸（5.5），緩慢加入到甲醇/乙腈混合溶液（5.12）中，用甲醇/乙腈混合溶液定容到500ml。稀釋溶劑：0.1%的甲酸去離子水溶液（5.11）/0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液（5.13），3+1。5.15抗生素標準貯備液：p=100mg/L（參考濃度）可直接購買有證標準溶液，也可用標準物質(zhì)（純度三95%）制備。貯備液在0C-4C避光保存或參照制造商的產(chǎn)品說明。使用時應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。使用標準物質(zhì)制備標準貯備液的參考方法：準確稱取10.0mg抗生素類化合物標準物質(zhì)，溶于100ml甲醇

8、（5.4）中，最終濃度為100mg/L。脫水紅霉素可直接購買標準物質(zhì)（純度三95%）或者由紅霉素制備，推薦的制備方法為：量取400pl100mg/L紅霉素貯備液于20ml棕色瓶中，加入19.6ml甲醇（5.4），然后加入約10pl硫酸溶液（5.9）調(diào)pH至酸性，室溫靜置4h后完成轉(zhuǎn)化過程，可于-10C以下避光保存2個月。5.16抗生素類化合物標準使用液：p1.0pg/ml（參考濃度）將12種抗生素類化合物標準貯備液（5.15）按需要用甲醇（5.4）稀釋。標準使用液于-10攝氏度以下避光保存，保質(zhì)期2個月。使用時應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。5.17內(nèi)標貯備液：p=200yg/ml（參考濃度）內(nèi)標物為1

9、3C3Atrazine（阿特拉津）。內(nèi)標可直接購買有證標準溶液，也可用標準物質(zhì)（純度三99%）制備。貯備液應(yīng)在-10C以下避光保存或參照制造商的產(chǎn)品說明。使用時應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。5.18替代物貯備液：p=200yg/ml（參考濃度）喹諾酮類回收率替代物為環(huán)丙沙星-d8、磺胺類回收率替代物為磺胺二甲氧嘧啶-d6、大環(huán)86內(nèi)酯類替代物為脫水紅霉素-d6。替代物可直接購買有證標準溶液，也可用標準物質(zhì)（純度三695%）制備。貯備液應(yīng)在-10C以下避光保存或參照制造商的產(chǎn)品說明。使用時應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。5.19內(nèi)標使用液：2.0yg/ml（參考濃度）將內(nèi)標貯備液（5.17）按需要用甲醇（5.4）

10、稀釋。內(nèi)標使用液于冷凍保存，保質(zhì)期1個月。使用時應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。5.20替代物使用液：2.0yg/ml（參考濃度）將替代物貯備液（5.18）按需要用甲醇（5.4）稀釋。替代物使用液于冷凍保存，保質(zhì)期1個月。使用時應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。5.21固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或同等柱效的萃取柱，規(guī)格為6ml/500mg。5.22濾膜：0.7gm玻璃纖維或其他材質(zhì)等效濾膜。5.23濾膜：0.22gm聚四氟乙烯或其它等效濾膜。5.24氮氣：純度三99.99%。儀器和設(shè)備除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的A級玻璃器皿。固相萃取裝置：自動或手動，流速可調(diào)節(jié)。6.

11、2濃縮裝置：自動氮吹濃縮儀或K-D濃縮器等性能相當?shù)脑O(shè)備。6.3液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子化源（ESI）。6.4色譜柱：C18或等效反相高效液相色譜柱，參考規(guī)格為：50mm（長度）x4.6mm（內(nèi)18徑），1.8gm（填料內(nèi)徑）。6.5樣品瓶：1000ml帶聚四氟乙烯內(nèi)襯墊瓶蓋的棕色玻璃瓶。微量注射器：10yl、20yl、50yl、100yl、250yl。一般實驗室常用儀器和設(shè)備。樣品7.1樣品的采集參照HJ/T91和HJ/T164的相關(guān)規(guī)定采集樣品。用預(yù)先洗滌干凈并干燥的磨口棕色玻璃瓶采集水樣，樣品采集時應(yīng)充滿樣品瓶（6.5），不留空隙。樣品保存水樣于現(xiàn)場立即添加鹽酸溶液（5.8）

12、調(diào)節(jié)樣品pH為2.04.0左右，并加入150mg抗壞血酸（5.7）及0.25gEDTA（5.6），在0C4C冷藏避光保存，7天內(nèi)分析完畢。試樣制備樣品預(yù)處理樣品采用固相萃取法富集前，水樣采用孔徑為0.7gm的玻璃纖維膜（5.22）過濾。固相萃取法分別用5ml甲醇（5.4）、5ml去離子水、5mlpH=2.0去離子水（5.10）活化固相萃取柱（5.21），保證小柱柱頭浸潤。量取500ml水樣，加入25.0gl替代物使用液（5.20），采用鹽酸溶液（5.8）調(diào)節(jié)水樣pH為2.04.0左右，水樣以1015ml/min的流速通過小柱。用去離子水淋洗小柱，去除小柱上的EDTA。之后用氮氣（5.24）吹掃

13、、干燥小柱。再用10ml甲醇（5.4）以5ml/min的流速洗脫小柱，洗脫液接收于收集管中。洗脫液經(jīng)氮吹（5.24，注意保持液面微微波動）濃縮至0.5ml左右，加入內(nèi)標使用液（5.19）25gl,用稀釋溶劑（5.14）定容到1.0ml,過0.22gm有機濾膜后待測?？瞻自嚇又苽湟詫嶒炗盟鏄悠?，按照水樣處理（7.3）相同操作步驟，制備固相萃取法空白試樣。分析步驟儀器參考條件液相色譜參考條件流動相：0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液（5.13,A相），0.1%甲酸去離子水溶液（5.11，B相）。梯度洗脫程序見附錄B。流速：0.3ml/min。柱溫：40C。進樣體積：20gl。質(zhì)譜參考條件離子源：電

14、噴霧離子源（ESI），正離子模式。毛細管電壓：4000V,干燥氣體溫度：350C，霧化器壓力：35psi干燥氣體流速：10L/min。多離子反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM），具體條件參見附錄C。對于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。儀器調(diào)諧按照儀器使用說明書在規(guī)定時間和頻次內(nèi)對液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀進行儀器質(zhì)量軸和分辨率調(diào)諧校正，以確保儀器處于最佳測試狀態(tài)。在儀器使用過程中，如發(fā)現(xiàn)儀器質(zhì)量數(shù)出現(xiàn)明顯偏差或靈敏度大幅度下降時，應(yīng)立即重新對儀器進行質(zhì)量軸和分辨率調(diào)諧。校準校準曲線的繪制取一定量抗生素類化合物標準使用液（5.16）、內(nèi)標物（5.19）及替代物使用液（5.20）于2ml

15、進樣小瓶中，制備不含原點的標準系列（至少5個濃度點），使抗生素類化合物及替代物的質(zhì)量濃度分別為2.0卩g/L、5.0卩g/L、10.0卩g/L、20.0卩g/L、50.0卩g/L、100yg/L和200yg/L（參考濃度），內(nèi)標的質(zhì)量濃度為50yg/L（參考濃度）。由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進樣，以標準系列溶液中目標組分的濃度為橫坐標，以其對應(yīng)的峰面積（或峰高）與內(nèi)標物峰面積（或峰高）的比值和內(nèi)標物濃度的乘積為縱坐標，建立校準曲線。線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)詳見附錄。y=ax+b（1）式中：x-目標組分濃度，yg/Ly-目標組分和內(nèi)標物的峰面積（或峰高）比值與內(nèi)標物濃度的乘積a-

16、校準曲線斜率b-校準曲線截距液相色譜/質(zhì)譜圖圖1目標物、替代物及內(nèi)標物的液相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖（濃度100|ig/L）注：1：磺胺嘧啶；2：氟羅沙星；3：氧氟沙星；4：諾氟沙星；5：環(huán)丙沙星-d8；6：環(huán)丙沙星；7：磺胺二甲嘧啶；8：磺胺間甲氧嘧啶；9：磺胺甲惡唑；10：螺旋霉素；10：11：磺胺二甲氧嘧啶；12：磺胺二甲氧嘧啶-d6；13：阿特拉津13C3；14：脫水紅霉素；15：脫水紅霉素-d6；16：羅紅霉素測定試樣測定按照與繪制標準曲線相同的儀器分析條件進行測定。8.3.1空白試驗按與試樣測定相同的儀器分析條件（8.1）進行空白試樣（7.4）的測定。結(jié)果計算與表示目標化合物的定性

17、分析每種被測組分選擇1個母離子和2個子離子進行監(jiān)測。在相同的實驗條件下，試樣中待測組分的保留時間與標準樣品中目標組分的保留時間比較，相對標準偏差的絕對值應(yīng)小于2.5%；且待測樣品譜圖中，各組分定性離子的相對豐度（Ksam）與濃度接近的標準溶液譜圖中對應(yīng)的定性離子相對豐度（Kstd）進行比較，偏差不超過表1規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。12種抗生素類化合物、3種替代物及1種內(nèi)標物的MRM譜圖見附錄D。KsamA2(2)式中：K-樣品中某組分定性離子的相對豐度，%，sama2-樣品中某組分定性離子對的峰面積（或峰高），A1-樣品中某組分定量離子對的峰面積（或峰高）。Kstd=std

18、1式中：Ktd標準品中某組分定性離子的相對豐度，%,std-A-標準品中某組分定性離子對的峰面積（或峰高），std2A府標準品中某組分定量離子對的峰面積（或峰高）。std1表1定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差單位：%標準樣品中某組分的定性離子的相對離子豐度（K丿stdKstd5020KstdW50101560000)2018012420d1iiA$66ib156)磺胺嘧啶定性(251.1-108)x1Q4W125327525225151.2510750.50.26-4I6?3iwiii5n?CountsvsAcquisitionTim磺胺二甲嘧啶定量(279-186)磺胺二甲嘧啶定性(27

19、9-156)ESIWRMFrag-lOO(hfCiD260(281IOOO0IO81000)201S0124200 xW*12m09-0.B-07-D.6-050.401020.1-iii4JiiilbI1!113141SCouncavsAcquisitionTime(min)磺胺間甲氧嘧啶定量(281.1-156.1)磺胺間甲氧嘧啶定性(281.1-108.1)0.9D.6101112131415CountsvsAcquisitionTimeImin)磺胺甲惡唑定量（254-156）磺胺甲惡唑定性（254-108）磺胺二甲氧嘧啶定量（311-156）磺胺二甲氧嘧啶定性（311-108）X10

20、2+ESIMRMFrag=114.0VCID21.0(316.3700-162.0000)2018012402.d2-11.8-11.6-1.4-1.2-20.6-0.4-_j_a-_nM-JIAJIIIIIIIIIIIIIII1234567891011121314Countsvs.AcouisitionTime(min)x1022.62.42.21.81.61.41.20.80.S0.40.2+ESIMRMFrag-1140VCID290(3163700-1080000)2018012402d1niiiiiiiiiiiii12345789101112131Countsvs.Acquisiti

21、cxiTim磺胺二甲氧嘧啶-d6定性（316.7-108）諾氟沙星定性(320-276.1)x1035.5JJ:0.；環(huán)丙沙星-d定量(340-314.1).；：匚8螺旋霉素定量(422.2-174)螺旋霉素定性(422.2-101)CourtsvskousibcriTeiw脫水紅霉素-d6定性(722-164.1)脫水紅霉素定量(716.5-158)脫水紅霉素-d6定量(722-164.1)羅紅霉素定量(716.5-158)xIO3凸MRMFfag=1U.WC1?0(2186(0-177.2CCCi45-35-iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii12345fi78910111213U

22、151617181920212213C3Atrazine定量T2T8.6-177.2)脫水紅霉素定性(716.5-558)附錄E（資料性附錄）方法的精密度和準確度表E.1方法的精密度化合物測定值（Rg/L）加標濃度（Rg/L）總均值（Rg/L）實驗室內(nèi)相對標準偏差/%實驗室間相對標準偏差/%重復(fù)性限r(nóng)/（Rg/L）再現(xiàn)性限R/（Rg/L）磺胺嘧啶0.04000.0312.514.812.70.0090.0130.2000.1641.410.411.20.0330.0600.4000.3152.29.213.20.0520.13磺胺二甲嘧啶0.04000.03075.813.317.20.010

23、0.0170.2000.1672.014.012.70.0400.070.4000.3253.210.615.20.0660.15磺胺間甲氧嘧啶0.04000.03155.712.920.40.0090.0200.2000.1593.111.913.30.0420.0710.4000.2961.49.816.30.0580.15磺胺甲惡唑0.04000.03324.913.020.60.0110.0110.2000.1624.014.615.80.0460.0830.4000.3003.511.914.90.0680.14磺胺二甲氧嘧啶0.04000.03558.614.812.20.0110

24、.0160.2000.1593.413.412.80.0430.0690.4000.3142.510.78.40.0670.096氟羅沙星0.04000.03784.014.58.10.0100.0130.2000.1871.413.417.20.0520.100.4000.3493.413.412.60.0810.14氧氟沙星0.04000.0384.214.210.30.0110.0150.2000.1812.512.415.20.0400.0850.4000.3421.913.314.80.0810.16諾氟沙星0.04000.0393.013.213.80.0100.0180.2000

25、.1724.412.414.80.0460.0830.4000.3096.713.014.70.0860.15環(huán)丙沙星0.04000.03855.913.517.10.0110.0210.2000.1724.412.414.80.0460.0830.4000.3211.716.415.10.0920.16螺旋霉素0.04000.03273.215.313.60.0100.0160.2000.1743.78.615.90.0320.0830.4000.3470.912.312.10.0920.14脫水紅霉素0.04000.04051.112.115.40.0110.0200.2000.1822.

26、312.916.70.0420.0930.4000.3433.913.58.10.0820.110羅紅霉素0.04000.03872.016.515.20.0120.0200.2000.1821.610.316.00.0350.0870.4000.3541.713.810.60.0770.126表E.2方法的準確度化合物名稱樣品類型實際樣品濃度（昭/L）加標濃度（昭/L）回收率范圍/%p2s/%磺胺嘧啶地下水0.000.040066.491.175.517.2地表水0.000.20062.885.778.416.4生活污水0.000.20060.697.077.222.5工業(yè)廢水0.000.4

27、0063.310288.029.1磺胺一甲嘧啶地下水0.000.040064.510176.327.3地表水0.000.20064.186.976.319.3生活污水0.000.20067.799.882.020.7工業(yè)廢水0.000.40077.693.487.013.3磺胺間甲氧嘧啶地下水0.000.040066.810277.730.5地表水0.000.20063.092.879.830.3生活污水0.000.20063.292.376.819.4工業(yè)廢水0.000.40070.411386.334.8磺胺甲惡唑地下水0.000.040066.397.281.530.0地表水0.000.20063.210381.829.5生活污水0.01910.20066.610185.030.5工業(yè)廢水0.000.40070.992.177.816.0磺胺一甲氧嘧啶地下水0.000.040078.398.788.018.5地表