1、電泳電泳:帶電粒子在電場中的定向移動(dòng)原理 :有效長度 :實(shí)際電壓原理V:泳動(dòng)速度cm/秒or分(秒-1,分-1) d:泳動(dòng)距離cm/電泳時(shí)間t(秒,分)E:電場強(qiáng)度 伏特/cmu:泳動(dòng)率or泳動(dòng)度(cm/伏 秒or分) U:電壓/支持場的長度 (有效長度) U:常壓(100500v) 高壓(50010000v) 僅需幾分鐘影響u的因素某一帶電粒子的u只取決于帶電質(zhì)點(diǎn)的性質(zhì)(內(nèi)因) 1 凈電荷 2 質(zhì)點(diǎn)大小 3 質(zhì)點(diǎn)形狀影響u的外因 1 V ( U/L) 2 緩沖液的PH (PH恒定) 3 I離子強(qiáng)度 I = 最適:0.020.2 4 電滲:液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 支持物:

2、單體丙稀酰胺(Acr) 交聯(lián)劑:甲叉(or亞甲)雙丙稀酰胺Bis 聚合 1光聚合:核黃素為催化劑(陽光,日光) 制大孔膠 2化學(xué)聚合: 過硫酸銨(NH4)2S2O3 APS (引發(fā)劑) N,N,N,N,-四甲基乙二胺 TEMED (加速劑) 制小孔膠聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠網(wǎng)孔大小: 聚合鏈長度:由Acr濃度 交聯(lián)程度:由Acr與Bis相對(duì)比例Bis的濃度低,孔徑大,可在聚合前調(diào)節(jié)單體與Bis的濃度比如: Acr Bis T(%) 小孔 28.0g 0.735g 7% 大孔 10.0g 2.5g 2.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳(圓盤式)PAG 分離血清Pr(一)不連續(xù)性 1 凝膠孔徑大小不同 單體濃

3、度 交聯(lián)度 大孔膠:T=3% C=20% 小孔膠:T=7% C=2.5%2 緩沖液離子成份的不連續(xù)性 大孔膠 PH=6.7 先行離子 存在于凝膠層中任何PH值下 隨后離子 存在于電極緩沖液中 PI=6.0 pK1=2.34 pK2=9.70在 PH=6.7時(shí),只有小部分解離為 配對(duì)離子Tris Pr分子在PH6.7時(shí)以Pr-形式存在 m:遷移率 :解離度3 PH的不連續(xù)性 PH 大孔(濃縮)膠 6.7 小孔(分離)膠 8.9 緩沖液 8.3(二)不連續(xù)性可控制Gly的解離度,從而控制有效遷移率 1.在大孔膠中,要求Gly的有效遷移率低于所有Pr,經(jīng)計(jì)算PH=6.7 2.在小孔膠中,要求Gly超

4、過所有Pr.Pr留在后面進(jìn)行普通的電泳與分子篩分離分成多個(gè)區(qū)帶.(此PH實(shí)測為9.5) 在 前 (三)三種物理效率使樣品分離效果好,分辨率高。1一般電泳分離的電荷效應(yīng). 帶電多,MW小, 遷移快2不連續(xù)系統(tǒng)對(duì)樣品的濃縮效應(yīng) 遷移率: 被壓成薄層3. 凝膠對(duì)樣品分子的篩選效應(yīng)等電聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF)原理: Pr為兩性電解質(zhì),不同Pr其aa的數(shù)量,種類及占比例不同,因此PI不同,PI范圍窄且凈電荷為零,因此依PI分離Pr. EF是在凝膠中加兩性載體電解質(zhì),通直流電后,可形成從陽極到陰極逐步增加的PH梯度(連續(xù)的,穩(wěn)定的,線性的PH)原理 當(dāng)Pr在電場中

5、遷移到它的PI時(shí),由于凈電荷為零,不再移動(dòng). 如擴(kuò)散,附近的凝膠會(huì)使其荷電,陽,陰極會(huì)重新吸引它回到PI位置.因此Pr只能在PI位置被濃縮成窄,穩(wěn)定的帶.稱這種濃縮效應(yīng)為聚焦. 只要凝膠中的PH梯度范圍足夠窄,便可將PI相近的Pr分開,EF是電泳技術(shù)中分辨率最高的技術(shù).等電聚焦方法(是EF的關(guān)鍵)1載體兩性電解質(zhì)CA 分辨率0.01PH2 固相PH梯度(1975年)IPG 以具弱酸或弱堿性質(zhì)的丙稀酰胺衍生物 CH2CHCONHR R=COOH R=4級(jí)氨基R為弱酸or弱堿,形成緩沖體系等電聚焦方法(是EF的關(guān)鍵) 分辨率達(dá)0.001PH PH梯度范圍最窄可為0.01PH/cm CAIEF是兩性

6、分子,在凝膠聚合時(shí)形成兩性分子在電場中,CA遷移到自己的PI而形成PH梯度.雙向凝膠電泳1.直徑1mm毛細(xì)管,進(jìn)行等電聚焦電泳2.取出膠條3.膠條放于 垂直板凝膠頂部 水平板凝膠一端4.進(jìn)行SDS電泳 以Pr的PI與MW兩種特征分離,分離效率高,可將數(shù)千個(gè)Pr分開.圖示毛細(xì)管電泳原理1.毛細(xì)管壁以玻璃.硅酸為主要成份 所以管壁帶一定負(fù)電荷2.管壁吸附溶液的陽離子(含H2O的正極端) 形成雙電層3.形成電滲:電場高壓下,雙電層水合陽離子引起流體(加毛細(xì)張力)整體向負(fù)極移動(dòng).4.樣品中不同組份受到的作用力有差別: 陽離子與電場力與電滲流同向,最快; 陰離子受方向相反的兩種力作用,電滲流力大于電場力

7、,移向負(fù)極最慢, 不帶電樣品受電滲流作用,移向正極(無電場力作用) 陰離子中性分子陽離子 毛細(xì)管電泳(ACE) Analytical Capillary Electrophoresis高效毛細(xì)管電泳(HPCE)特點(diǎn): 1.可分離各種成份(帶電與不帶電) 2.電滲成為有效驅(qū)動(dòng)力(普通電泳中為破壞力) 3.高速度分力能力:各種制品均可在330內(nèi)高速分離(45內(nèi),分離15種糖)ACE特點(diǎn) 4.高分辨力:分辯力大于106理論段/m.最小監(jiān)測量:10-6M . 如脫酰胺作用 5.質(zhì)量感度:應(yīng)用激光誘發(fā)熒光的檢測器,可檢測aM水平(10-18,PM:10-12 fM:10-15) 6.用樣量: L 實(shí)際上是 n L 7.自動(dòng)化程度:自動(dòng)加樣,自動(dòng)交換緩沖液,自動(dòng)分離,自動(dòng)數(shù)據(jù)處理.ACE特點(diǎn) 8.適用范圍廣: aa衍生物 肽,Pr 核酸,藥物.病毒 水溶維生素 糖類衍生物 9.檢測: 紫外/可見光 熒光 電化學(xué) 激光 同位素SDSPAGE原理 Pr溶液中 加巰基乙醇 加SDS,打開氫鍵與疏水鍵 復(fù)合物 1.4g ： 1g 加入SDS為SO4-2改變了Pr的荷電性質(zhì).SDSPAGE各種SDS-Pr均帶相同密度的負(fù)電荷，其