1、高效有機物降解菌的構(gòu)建技術(shù)講解和相關(guān)策略 第一節(jié) 高效有機物降解菌的構(gòu)建技術(shù) 一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù) 二、誘變技術(shù) 三、細(xì)胞融合技術(shù) 四、基因重組技術(shù) 五、基因工程第三章 高效有機物降解菌的構(gòu)建技 術(shù)和策略第二節(jié) 高效有機物降解菌的構(gòu)建策略 一、優(yōu)化污染物的降解途徑 1.重組互補代謝途徑 2.改變污染物代謝產(chǎn)物流向 二、提高污染物生物可利用性 三、增強細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性 第一節(jié) 高效有機物降解菌的構(gòu)建技術(shù) 一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù) 不經(jīng)人工誘變，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程稱為自然選育或自然分離。 微生物自然突變有兩種原因： (1)自然環(huán)境中存在的低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低濃度的

2、誘變物質(zhì)和微生物自身代謝產(chǎn)生誘變物質(zhì)的作用引起的突變； （2）在DNA的復(fù)制過程中所發(fā)生的錯配。 一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)來源：土壤、水、空氣、動植物極其腐敗殘體、有機物污染地區(qū)、污水處理系統(tǒng)中。采樣 增殖培養(yǎng) 純種分離 篩選 性能鑒定一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)采樣：應(yīng)根據(jù)篩選的目的、微生物分布情況、菌種的主要特征極其生態(tài)關(guān)系等因素，確定具體時間、地點和目標(biāo)物。增殖：為提高分離效率，常以投其所好的原則在培養(yǎng)基中添加特殊的養(yǎng)分，使其所需菌種的數(shù)量相對增加。主要是利用不同微生物的生長繁殖對環(huán)境和培養(yǎng)基的特殊要求進(jìn)行富集培養(yǎng)和要求，控制這些條件使之有利于某類和某種微生物，而對其它微生物不利，再對培養(yǎng)時間加

3、以控制，可以達(dá)到初步的分離和富集目的。 一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)純化：從“種”的水平來說是純的，其方法有劃線分離法、涂布分離法和稀釋分離法。：較為精細(xì)的單孢子或單細(xì)胞分離法。性能鑒定：菌的生長情況、酶活測定、效果測定自然選育是一種簡便易行的選育方法。但自然選育的效率低（10-810-10）。二、誘變育種 誘變育種是人為地利用物理、化學(xué)等因素，使誘變的細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)染色體或DNA的片段發(fā)生缺失、易位、倒位、重復(fù)等畸變，或DNA的某一部位發(fā)生改變(又稱點突變)，從而使微生物的遺傳物質(zhì)DNA或其化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起微生物的遺傳變異。因此，誘發(fā)突變的頻率遠(yuǎn)大于自然突變。 誘變過程出發(fā)菌株的選擇：純種作

4、為出發(fā)菌株，借以排除異核體或異質(zhì)體的影響； 2.不僅效果好，而且要考慮其它形狀，如生長快、營養(yǎng)要求低等； 3.對誘變劑敏感的菌株； 4.選擇已經(jīng)誘變過的菌株。誘變劑的選擇（物理：紫外線、X射線等，化學(xué)：堿基類似物，5-氟尿嘧啶；烷化劑，亞硝基胍，甲基磺酸乙酯）要考慮誘變劑本身的特點，如紫外線作用于DNA分子的嘧啶堿基，而亞硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤堿基，兩者復(fù)合使用，突變譜寬，效果較好。 誘變過程影響誘變效果的因素： 菌種的生理狀態(tài)：對分裂中的細(xì)胞更有效； 細(xì)胞懸浮液要求生理狀態(tài)一致，為分散均勻的單細(xì)胞或單孢子懸浮液（一方面分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面可避免長出不純菌落）。

5、 誘變過程 誘變劑的劑量：誘變率隨誘變劑量的增加而提高，但達(dá)到一定程度后，再提高劑量，反而會使誘變率下降，使負(fù)變異株多，因此，主張用中等劑量，如75%-80%或更低劑量。 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)。復(fù)合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時使用，也可以用同一誘變劑重復(fù)使用。復(fù)合處理可擴大突變的位點范圍，使獲得正突變菌株的可能性增大。 篩選過程特點：發(fā)生頻率低；隨機性大過程：先初篩，后復(fù)篩，測突變菌株性能誘變育種的基本篩選程序：出發(fā)菌株絕大多數(shù)個體死亡，少數(shù)存活（存活率）少數(shù)突變（突變率）少數(shù)正變（正變率）少數(shù)降解酶活增加幅度大（增加率）且要求穩(wěn)定 三. 原生質(zhì)體融合 原生質(zhì)體融合 (Prot

6、oplast fusion)指在一定選擇條件下，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子。 始于1976年，最早是在動物實驗中發(fā)現(xiàn)的，后來早微生物中得以應(yīng)用。使細(xì)胞間基因重組的頻率大大提高了，已大于10-1 （而誘變育種一般僅為10-6 ）。發(fā)生基因重組親本的選擇范圍更大，可以在不同種、屬、科，甚至更遠(yuǎn)緣的微生物之間進(jìn)行。三. 原生質(zhì)體融合 在有些情況下，兩種或多種微生物在共同存在時才能降解某種污染物，單獨存在時不能降解該污染物，這可能是因為彼此為對方提供了生長所必須的條件或為對方消除了生長的障礙，使得它們在共存的條件下能夠順利降

7、解環(huán)境污染物。 在這種情況下，可以采用原生質(zhì)體融合技術(shù)融合這兩種微生物，融合子就會具備兩個親本的基因與優(yōu)點，能夠降解某種環(huán)境污染物，這也是目前污染治理工程菌制備的一個主要途徑。三. 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合特點：1 雜交頻率較高2 遺傳物質(zhì)體傳遞更為完整3 存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能4 提高效果的潛力較大三. 原生質(zhì)體融合：必須選遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株，而且必須帶有可以識別的遺傳標(biāo)記（多為營養(yǎng)缺陷型或抗藥性標(biāo)記）。：去除細(xì)胞壁是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果較好。 影響因素：菌體前處理、菌齡、酶濃度、酶處理溫度、PH、滲透壓穩(wěn)定劑（不

8、僅起保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合。 原生質(zhì)體對滲透壓極其敏感，低滲引起細(xì)胞破裂。多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有機物和氯化鉀和氯化鈉mol/L之間。三. 原生質(zhì)體融合：融合促進(jìn)劑：聚乙二醇（PEG，濃度為25%40%）可有效促進(jìn)原生質(zhì)體融合。 另外，紫外線照射和脈沖電場等物理因素處理也能促進(jìn)原生質(zhì)體融合。：是使原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)?？稍偕闹徽荚|(zhì)體的一部分，細(xì)菌再生率為3%10%；真菌為20%80%。用再生培養(yǎng)基。 提高再生率必須避免因強力動作而使原生質(zhì)體破裂，另外菌液濃度不宜太高。菌齡、再生時的溫度、溶菌酶用量和溶壁時間、細(xì)胞壁去除程度等因素都

9、會影響再生。三. 原生質(zhì)體融合：原生質(zhì)體融合后，來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代成為融合重組子。這種重組子通過兩親株遺傳標(biāo)記的互補而得以識別。（真正的融合和暫時的融合） 融合子生理生化測定。 原生質(zhì)體技術(shù)還可用于誘變育種中。四、基因重組技術(shù) 受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它整合到自己的基因組中，再經(jīng)復(fù)制就使自己變成一個轉(zhuǎn)化子。 在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象。能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞必須處于感受態(tài)（受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)）。感受態(tài)因子是一種胞外蛋白。 可能是細(xì)胞膜上的一種組成，催化DNA吸收據(jù)推測 可能是一種自溶酶轉(zhuǎn)化

10、因子 本質(zhì)：DNA 大小：占細(xì)菌核染色體組的0.3%，含15個基因。 轉(zhuǎn)化頻率：0.1%1%，最高達(dá)10%。 呈質(zhì)粒形式的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高，因為它進(jìn)入受體菌后，可不必同受體染色體進(jìn)行交換、整合即可進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA。 過程：1）雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體細(xì)胞表面的特異位點結(jié)合；2）在吸附位點上的DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成片段；3）一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞；4）DNA片段與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對，交換、整合和取代，形成雜合DNA片段；5）受體菌染色體復(fù)制，一個為轉(zhuǎn)化子，一個不是。 通過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的媒介，把供體細(xì)

11、胞的DNA小片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。2.傳導(dǎo)通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何DNA小片段的“誤包”，而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的傳導(dǎo)現(xiàn)象。完全缺陷噬菌體：當(dāng)噬菌體在供體菌內(nèi)增殖時，宿主的核染色體組斷裂，待噬菌體成熟與包裝之際，極少數(shù)噬菌體的衣殼與噬菌體頭部DNA芯子相仿的一小段供體菌DNA片段誤包入其中，形成了一個不含噬菌體自身DNA的假噬菌體。 進(jìn)行完全普遍傳導(dǎo)和流產(chǎn)普遍傳導(dǎo)2. 傳導(dǎo)完全普遍傳導(dǎo)：完全缺陷噬菌體將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，該片段可與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對，再經(jīng)過雙交換而整合到受體菌染色體組上，使后者成為一個遺傳性

12、狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。流產(chǎn)普遍傳導(dǎo)：經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得的供體菌DNA片段的受體菌，如果外源DNA在其內(nèi)不進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消失，而僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯和性狀表達(dá)。3、接合 供體菌（雄）通過其性菌毛與受體菌（雌）相接觸，前者傳遞不同長度的單鏈DNA給后者，并在后者細(xì)胞中進(jìn)行雙鏈化或進(jìn)一步與核染色體發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象。F因子：決定性別的質(zhì)粒 基因工程是分子水平上在生物體外用人工方法進(jìn)行的重組，以改變生物的性狀創(chuàng)造生物的新品種或新物種的一門新學(xué)科。 對于環(huán)境中難以降解的有毒有害化合物，可通過基因工程的方法，設(shè)計新的代謝途徑，利用相關(guān)的基因構(gòu)建工程菌。這樣不僅提高細(xì)胞單一

13、酶的濃度增加代謝途徑中某一限制酶的表達(dá)，還能使代謝途徑中所有基因的表達(dá)獲得同步增加，從而大大提高降解效率，促使有毒化合物分子進(jìn)一步降解為無害的末端產(chǎn)物。 主要過程：獲得特定的目標(biāo)基因 目標(biāo)基因片段 DNA重組 載體 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞并擴增、表達(dá) 具目標(biāo)基因表達(dá)功能重組體黏性末端黏性末端1、限制性核酸內(nèi)切酶限制酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，一種限制性內(nèi)切酶只能識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開（切割DNA分子）來源：主要從原核細(xì)胞分離 作用： 作用結(jié)果：EcoRI基因工程的“專用工具”平未端及粘性未端什么叫黏性末端？ 被

14、限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？ 會產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了?；虻尼樉€：DNA連接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G

15、同種限制酶切割基因的針線DNA連接酶 DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來(形成磷酸二酯鍵)，這樣一個重組的DNA分子就形成了。導(dǎo)入過程需要運輸工具運載體。運載體的作用有哪些？作用一：作為運載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。作用二：利用運載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。 （一）載體基因克隆載體條件：（1）具有能使外源DNA片段組入的克隆位點。（2）能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞或游離在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨DNA復(fù)制而復(fù)制。（3）必須具有遺傳標(biāo)記，承載外源DNA的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，以便篩選克隆子。常用的運載體主要有

16、兩類： 1）質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動植物病毒質(zhì)粒1.質(zhì)粒的定義 ：一般來說符合以下 3條標(biāo)準(zhǔn)的染色體外的DNA或RNA分子都可以稱之為質(zhì)粒：(1)質(zhì)粒是染色體外能自主復(fù)制的遺傳因子；(2)不具備胞外期的感染性 ；(3)它對宿主來說不是必需的。構(gòu)建質(zhì)粒載體一般選用分子小和松弛型復(fù)制的質(zhì)粒。 松弛型質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)可含10200個拷貝，而且不受宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響，當(dāng)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成停止時，質(zhì)粒DNA的復(fù)制仍可以繼續(xù)進(jìn)行，甚至可以將拷貝數(shù)增加至數(shù)千個。 細(xì)菌對環(huán)境中的特異性限制因子的應(yīng)答能力一般是由質(zhì)粒控制的，因此，質(zhì)粒在為宿主細(xì)胞提供遺傳多樣性及其利用大范圍生態(tài)位的適應(yīng)中起著非常重要的作用

17、。 大腸桿菌的質(zhì)粒： 最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如抗四環(huán)素的標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對宿主細(xì)胞生存沒有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價閉合環(huán)（SC構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）線狀雙螺旋（L構(gòu)型）五. 基因工程 質(zhì)粒的大小一般為染色體的0.05%20%或更多，長度為 120kb，有時細(xì)菌中含有大小不同的質(zhì)粒。 質(zhì)?？梢砸圆煌姆绞皆诩?xì)菌的種群中傳遞，轉(zhuǎn)移的頻率大到102,而染色體的轉(zhuǎn)移頻率卻只有106108。 假單胞菌中，發(fā)現(xiàn)有分解功能的質(zhì)粒，帶有這些質(zhì)粒的菌表現(xiàn)為具有降解非正常碳源，如

18、樟腦、辛烷、水楊酸等的能力。質(zhì)粒的消除試驗則是鑒定質(zhì)粒功能的又一重要手段，通過消除質(zhì)粒來觀察寄主細(xì)胞是否喪失某些性狀。 五. 基因工程1）細(xì)菌質(zhì)粒是雙股的共價閉合環(huán)狀DNA分子，即cccDNA。2）每一種質(zhì)粒有自己特定的核苷酸序列，所以每一種限制酶對每一種質(zhì)粒都有固定的切點數(shù)和切點位置。3）質(zhì)粒都有自主復(fù)制功能。4）不僅能自主復(fù)制，而且能平均分配到兩個子細(xì)胞中，從而使質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳。5）具有不相容性。6）都具有一定寄主范圍。五. 基因工程7）對寄主細(xì)胞是非必須的。8）質(zhì)粒DNA能通過轉(zhuǎn)化作用引入到細(xì)菌細(xì)胞。9）某些質(zhì)粒為一些特殊的表型編碼，可稱抗性質(zhì)粒、代謝質(zhì)粒和毒素質(zhì)粒等。10）分子量大的質(zhì)

19、粒一般具有接合功能，即借助于細(xì)胞間接觸，供體菌的質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)移至受體菌中。11）有些質(zhì)?？梢砸杂坞x于寄主染色體和與染色體整合兩種狀態(tài)存在。12）質(zhì)?？捎米骰蜉d體。質(zhì)粒pBR322pBR3224363結(jié)構(gòu)：（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr） 3種限制酶單一識別位點 。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）內(nèi)部有7種，啟動區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識別位點 。（3）DNA復(fù)制起點（ori）pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點：（1）具有較小的分子量。 4363bp，106Da，（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 （3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后,每個細(xì)胞中可累積1000300

20、0個拷貝。（4）對多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個能切割的位點。 pBR3224363五. 基因工程3.質(zhì)粒的生態(tài)遺傳學(xué)意義 質(zhì)粒有著重要的生態(tài)遺傳學(xué)意義，它們作為“微染色體”能從一個細(xì)胞中方便地分離出來，并方便地轉(zhuǎn)入到另一個細(xì)胞中去，這一特征為現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展提供了重要的工具和手段。在 DNA克隆方法學(xué)的發(fā)展進(jìn)程中，質(zhì)粒起著至關(guān)重要的作用，以質(zhì)粒作為運載體在細(xì)菌中擴增和表達(dá)許多外源基因的方法和技術(shù)，在工、農(nóng)、醫(yī)各個領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用，并極大地拓展了人們對質(zhì)粒微生物學(xué)認(rèn)識的視野。4、載體和目的基因重組4.1以質(zhì)粒為載體的重組 質(zhì)粒是最常用的載體。優(yōu)點：分子量小，可自主或半自主復(fù)制，有

21、多個選擇性標(biāo)記，多個酶切位點，拷貝數(shù)多，性能穩(wěn)定?？陕〉淖畲驞NA片段一般在10kb左右。 4.2以噬菌體為載體的重組 先把降解性基因克隆進(jìn)噬菌體內(nèi)，將重組經(jīng)體外包裝成成熟噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導(dǎo)入寄主細(xì)胞。其優(yōu)點在于克隆效率較高，降解性基因整合進(jìn)寄主染色體后比較穩(wěn)定。缺點是包裝限制問題，對于片段大于 2 3降解性基因則不能成功地被克隆。 四個基本步驟：（三）基因操作的基本步驟1）提取目的基因2）目的基因與運載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測和表達(dá) 目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。 如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《尽⒖辜?xì)菌）基因、

22、降解有機物的降解基因等。目的基因：包括轉(zhuǎn)錄的啟動區(qū)、基因編碼區(qū)和終止區(qū)的全功能基因。步驟一：目的基因的提取目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法 在獲取真核細(xì)胞中的目的基因時,一般用人工合成基因的方法.哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動測序儀：2）PCR技術(shù)： 對提取出來的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。步驟二：目的基因與運載體重組 1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。 2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的

23、切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒） 目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程?；虿僮鞯幕静襟E目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1、將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。2、使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。3、目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？欤诤芏痰臅r間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。常用的受體細(xì)胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞導(dǎo)入擴增導(dǎo)入過程：運載體為質(zhì)粒，

24、受體細(xì)胞為細(xì)菌受體細(xì)胞：細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制氯化鈣大量的目的基因步驟四 克隆子的篩選和鑒定 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，真正獲得目的基因并能有效表達(dá)的克隆子只是一小部分。1 利用克隆載體攜帶的選擇標(biāo)記基因篩選克隆子。A 利用抗菌素抗性基因進(jìn)行篩選 Ampr （抗氨芐青霉素） Cmpr （抗氯霉素） kanr （抗卡那霉素）Tetr （抗四環(huán)素） Strr （抗鏈霉素）。 當(dāng)含任何一種抗菌素抗性基因的載體處理不具這種抗性基因的受體細(xì)胞，并在含相應(yīng)抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，只有獲得載體的受體細(xì)胞才能繼續(xù)生長，這樣便可篩選出含克隆載體的克隆子。外源DNA

25、pBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端黏性末端連接酶重組子(ampstetr) 空載體(amprtetr) 野生型的 (ampstets) 導(dǎo)入涂布在含Tc的平板上重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr) 空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)影印在含Ap的平板上空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)對比兩個平板上的菌落，凡在Tc平板上生長而在Ap平板上不能生長的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。克隆子篩選與鑒定B 利用乳糖操縱子lacZ 基因篩選克隆子 具有完整乳糖操縱子的菌體能翻譯-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和乙酰

26、基轉(zhuǎn)移酶（A），當(dāng)培養(yǎng)基中含有X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖苷）時，可產(chǎn)生藍(lán)色沉淀物，使菌落成藍(lán)色。當(dāng)目的基因插入后lacZ 基因不能表達(dá)，因此，帶有目的基因的重組子菌落呈白色，而沒有轉(zhuǎn)入目的基因的菌落呈蘭色?？寺∽雍Y選與鑒定2 克隆子的進(jìn)一步鑒定用上述方法篩選的克隆子，難免得到一些假克隆子，為進(jìn)一步鑒定克隆子的真假，可采用限制性內(nèi)切酶分析、分子雜交、PCR擴增和DNA測序、目的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物檢測等方法。第二節(jié) 基因工程菌構(gòu)建策略 自1973年Jackson等人首次提出基因可以人工重組，并能在細(xì)菌中復(fù)制以來，基因工程作為一個新興

27、的研究領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展，取得了喜人的成績。 因各種環(huán)境條件和生物因子的限制，細(xì)菌的進(jìn)化是相當(dāng)緩慢的而且沒有一定的方向，因此通過基因工程促進(jìn)細(xì)菌的遺傳進(jìn)化以滿足生物修復(fù)工程的需要。 （1）重組互補代謝途徑： 系列酶（不同菌共代謝）有機污染物 小分子化合物缺點：降解速率慢，因為污染物代謝產(chǎn)物在不同降解菌間的跨膜轉(zhuǎn)運是耗能過程，對細(xì)菌來說這是一種不經(jīng)濟的營養(yǎng)方式。另外，某些污染物的中間代謝產(chǎn)物可能具有毒性或?qū)Υx活性有抑制作用，如不能被迅速代謝利用，積累后將對整個代謝過程產(chǎn)生抑制作用。 因此對這些細(xì)菌的降解基因進(jìn)行重組，將分屬于不同細(xì)菌個體中的污染物代謝途徑組合起來來構(gòu)建具有特殊降解功能的超級降解菌，可以有效的提高微生物降解能力，從而提高生物修復(fù)效率。 抑制劑 脫氯 ohb 脫鹵素基因 聯(lián)苯雙加氧酶 （bph A） 氯代苯甲酸(CBA)多氯聯(lián)苯 （PCBs） O2 異戊二烯酸 重組體Bph:ohb