1、SANYO三洋泰州安康OLYMPUSOLYMPUS元儀盧湘儀上海一，恒PerkinElmerHettichHDL梅特勒-托利多優(yōu)普ThermoBio-RadBio-RadBio-RadBio-RadIKA實(shí)驗(yàn)計(jì)劃 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模翰捎肏EK293/a 1D-AR/Ga 16細(xì)胞模型，通過鈣流實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)關(guān)黃柏的四個(gè)血中 移行成分小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮及木蘭堿對(duì) a1D型腎上腺素能受體的阻滯作用，表征 成分的抗前列腺炎潛在活性；在22RV1人前列腺癌細(xì)胞上，通過MTT及相關(guān)分子生物學(xué)分 析評(píng)價(jià)以上四種血中移行成分的治療前列腺癌活性。第一章關(guān)黃柏血中移行成分抗前列腺炎活性評(píng)價(jià)1實(shí)驗(yàn)材料1.1儀器與試劑1.

2、1.1實(shí)驗(yàn)儀器：CO2培養(yǎng)箱紫外消毒柜倒置熒光顯微鏡倒置顯微鏡超微量分光光度計(jì)離心機(jī)干燥箱熒光讀板儀低溫離心機(jī)生物安全柜電子分析天平超純水機(jī)離心機(jī)（?。╇娪緝x電泳成像儀熒光PCR儀梯度PCR儀磁力攪拌器立式蒸汽壓力滅菌器上海博訊水浴鍋IKA流式細(xì)胞儀默克密理博1.1.2實(shí)驗(yàn)材料：HEK293/a 1D-AR/Ga 16 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，22RV1 人前列腺癌細(xì)胞(ATCC)，ABT-594和 RJR2403 陽性化合物(腎上腺素、咖啡因？)，96-孔黑邊透明底 Greiner plate( pClear/ClearBottom),Milliporeviacount reagent，DMEM 高糖培

3、養(yǎng)液(Applichem，Germany),HBSS( Hyclone, USA),臺(tái)盼藍(lán)(Sigma，USA)，RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO, Trypsin-EDTA， HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗鈣流檢測(cè)試劑盒，乙醇其它試劑均為分析純級(jí)。2方法2.1細(xì)胞株培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)從-80C中取出凍存管，立即投入37水浴,并不斷的搖動(dòng)，使之迅速融化。 將溶解的細(xì)胞凍存管取出，用酒精消毒后打開，吸出溶有細(xì)胞的凍存液，加入事先裝好培養(yǎng)液(37C預(yù)熱，810倍體積)離心管內(nèi),稍微吹打混勻，然后1000rpm 5min,去除上清,加入適量

4、培養(yǎng)液，吹打成細(xì)胞懸液，以1x105/mL密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37C、5%CO2及飽 和濕度下培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM (High glucose)培養(yǎng)液中，同時(shí)加入400 p g/mL G418。消化細(xì)胞使用含0.05%EDTA的Trypsin溶液。2.2細(xì)胞的傳代HEK293/a 1D-AR/Ga 16細(xì)胞48h換液1次，細(xì)胞長至60%70%融合時(shí)，用0.25%胰酶消 化12min，將培養(yǎng)瓶再用手掌輕輕敲打使細(xì)胞脫壁、懸浮、分散，為使細(xì)胞進(jìn)一步分散可 用吹打管輕輕吹打幾次，獲得細(xì)胞懸液，然后加入倍量的培養(yǎng)基，溫和混勻，吸管分裝混合 液，傳代擴(kuò)增細(xì)胞。并凍存細(xì)胞備用，凍存

5、細(xì)胞使用含10%DMSO或甘油、1020%小牛 血清的凍存培養(yǎng)液。2.3細(xì)胞形態(tài)的觀察在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞的生長情況及形態(tài)特征。2.4細(xì)胞的計(jì)數(shù)常規(guī)消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓、脫壁并浮起，加入少量培養(yǎng)基離心，再用milliporeviacount按 比例重懸并吹打制成細(xì)胞懸液。預(yù)熱guava流式細(xì)胞儀，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。2.5細(xì)胞的貼壁率指數(shù)生長期的細(xì)胞，以0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后分別接種于12個(gè)25cm2培養(yǎng) 瓶中，每?jī)尚r(shí)隨機(jī)取出3瓶細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞，加入胰消化酶消化、計(jì)數(shù)已 貼壁細(xì)胞，取其平均值，按照公式：貼壁率(%)=(已貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))

6、X100%，計(jì)算 貼壁率。2.6生長曲線細(xì)胞生長曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì) 胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長 短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入 平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，典型的生長曲線可 分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺(tái)狀的平頂期及退化衰亡4個(gè)部分。 以存活細(xì)胞數(shù)(萬/mL)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間(h或d)作圖，即得生長曲線。取指數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶 消化制成單細(xì)胞懸液，以1x104/孔接種于24孔板，每孔加入

7、1mL培養(yǎng)基。每天隨機(jī)取3 孔，計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞的數(shù)目并計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)10d，繪制細(xì)胞生長曲線?；虿捎门_(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法：取不同時(shí)間段生長的原代小鼠肝細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/mL)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。MTT檢測(cè)法：細(xì)胞接種在96孔板上，200ul/孔,培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液做為空白對(duì)照。加入0.1 mL MTT于37C孵育4 h。使MTT還原為藍(lán)紫色甲贊結(jié)晶。加入150ul/孑L的DMSO,搖床上低速震蕩15min，使藍(lán)色的結(jié)晶充分溶解后，在酶標(biāo)儀上在OD值490nm處檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞成活率，繪制細(xì)胞生長曲線。2.7細(xì)胞形態(tài)觀

8、察并記錄利用倒置相差顯微鏡觀察生長過程中細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。2.8鈣流實(shí)驗(yàn)配體門控離子通道受體是繼G蛋白偶聯(lián)受體和核激素受體家族之后的又一重要的受體靶標(biāo)。 建立基于配體門控離子通道受體介導(dǎo)的鈣流變化的藥物篩選模型，將細(xì)胞與Ca2+敏感的 熒光探針(Fluo-4)共同孵育，使用陽性化合物(ABT- 5 9 4 )來激動(dòng)Flu。一4標(biāo)記細(xì)胞，通過加入被測(cè)化合物后熒光讀板儀檢測(cè)到的鈣流變化，觀察被篩選化合物激動(dòng)或拮抗鈣流反應(yīng)的能力，篩選出對(duì)a 1D-AR起拮抗作用的藥物2.8.1鈣流反應(yīng)緩沖液配制HEPES 10 mmol/L, NaCl 5 mmol/L, KCl 5 mmol/L, CaCl

9、 mmol/L,N-methyl-D-glucamine 140 mmol/L, glucose 10 mmol/L，室溫下調(diào) pH 值到 7.4。2.8.2細(xì)胞內(nèi)鈣流的檢測(cè)方法待細(xì)胞融合度達(dá)70%-90%時(shí)，收集于直徑10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的 HEK293/a 1D-AR/Ga 16 細(xì)胞，加入 Fluo-4 5 p mol/L 和 2.5 mmol/L Probenecid，室溫下避光孵育 30 分鐘后，使用鈣流反應(yīng)緩沖液洗滌2遍。以80 p l/孔接種到96孔黑邊透明底的Greiner 板中，細(xì)胞密度約6X104/o使用PE熒光讀板儀，加入一定濃度的化合物溶液20 p L/孔，在激

10、發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度120秒。2.8.3數(shù)據(jù)采集與處理取鈣流曲線的峰值讀數(shù)來量化該點(diǎn)化合物的鈣流反應(yīng)。數(shù)據(jù)的非線性回歸擬合及作圖采用 GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.，San Diego, CA, USA)軟件。同時(shí)可以利用熒光顯 微鏡拍照記錄?；衔镆种坡视?jì)算公式：化合物抑制率=(ABT-594引發(fā)的峰值讀數(shù)一各化合物引發(fā)的峰值讀麴/ABT-594引發(fā)的峰值讀數(shù)X100%第二章關(guān)黃柏血中移形成分抗前列腺癌活性評(píng)價(jià)1實(shí)驗(yàn)材料1.2儀器與試劑1.1.1實(shí)驗(yàn)儀器：CO2培養(yǎng)箱SANYO三洋紫外消毒柜泰州安康倒置熒光顯微

11、鏡OLYMPUS倒置顯微鏡OLYMPUS超微量分光光度計(jì)元儀離心機(jī)盧湘儀干燥箱上海一，恒熒光讀板儀PerkinElmer低溫離心機(jī)Hettich生物安全柜HDL電子分析天平梅特勒-托利多超純水機(jī)優(yōu)普離心機(jī)（?。㏕hermo電泳儀Bio-Rad電泳成像儀Bio-Rad熒光PCR儀Bio-Rad梯度PCR儀Bio-Rad磁力攪拌器IKA立式烝汽壓力火菌器上海博訊水浴鍋IKA流式細(xì)胞儀默克密理博1.1.2實(shí)驗(yàn)材料：HEK293/a 1D-AR/Ga 16 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，22RV1 人前列腺癌細(xì)胞(ATCC)，ABT-594和 RJR2403 陽性化合物，96-孔黑邊透明底 Greiner plate(

12、pClear/Clear Bottom),Milliporeviacount reagent， DMEM 高糖培養(yǎng)液(Applichem，Germany),HBSS( Hyclone, USA),臺(tái)盼藍(lán)(Sigma，USA)， RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO，Trypsin-EDTA，HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗鈣流檢測(cè)試劑盒，乙醇其它試劑均為分析純級(jí)。2方法2.1細(xì)胞株培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)從-80C中取出凍存管，立即投入37水浴,并不斷的搖動(dòng)，使之迅速融化。將溶解的細(xì)胞凍存管取出，用酒精消毒后打開，吸出溶有細(xì)胞的凍存液，加入事先裝好

13、培養(yǎng)液（37C預(yù)熱，810倍體積）離心管內(nèi),稍微吹打混勻，然后1000rpm 5min，去除上清,加入適量 培養(yǎng)液，吹打成細(xì)胞懸液，以1x105/mL密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37C、5%CO2及飽 和濕度下培養(yǎng)于含有10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)液中。消化細(xì)胞使用含0.05%EDTA的 Trypsin 溶液。2.2細(xì)胞的傳代22RV1人前列腺癌細(xì)胞長至60%70%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化12min,將培養(yǎng)瓶再用 手掌輕輕敲打使細(xì)胞脫壁、懸浮、分散，為使細(xì)胞進(jìn)一步分散可用吹打管輕輕吹打幾次，獲 得細(xì)胞懸液，然后加入倍量的培養(yǎng)基，溫和混勻，吸管分裝混合液，傳代擴(kuò)增細(xì)胞。并凍存 細(xì)

14、胞備用，凍存細(xì)胞使用含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。2.3細(xì)胞形態(tài)的觀察在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞的生長情況及形態(tài)特征。2.4細(xì)胞的計(jì)數(shù)常規(guī)消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓、脫壁并浮起，加入少量培養(yǎng)基離心，再用milliporeviacount按 比例重懸并吹打制成細(xì)胞懸液。預(yù)熱guava流式細(xì)胞儀，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。2.5細(xì)胞的貼壁率指數(shù)生長期的細(xì)胞，以0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后分別接種于12個(gè)25cm2培養(yǎng) 瓶中，每?jī)尚r(shí)隨機(jī)取出3瓶細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞，加入胰消化酶消化、計(jì)數(shù)已 貼壁細(xì)胞，取其平均值，按照公式：貼壁率（%）=（已貼壁細(xì)胞數(shù)/接

15、種細(xì)胞數(shù)）X100%，計(jì)算 貼壁率。2.6生長曲線細(xì)胞生長曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì) 胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長 短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入 平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，典型的生長曲線可 分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺(tái)狀的平頂期及退化衰亡4個(gè)部分。 以存活細(xì)胞數(shù)（萬/mL）對(duì)培養(yǎng)時(shí)間（h或d）作圖，即得生長曲線。取指數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶 消化制成單細(xì)胞懸液，以1x104/孔接種于24孔板

16、，每孔加入1mL培養(yǎng)基。每天隨機(jī)取3 孔，計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞的數(shù)目并計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)10d，繪制細(xì)胞生長曲線?；虿捎门_(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法：（1）取不同時(shí)間段生長的原代小鼠肝細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)（2）根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞數(shù)/mL）為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。MTT檢測(cè)法：（1）細(xì)胞接種在96孔板上，200ul/孔,培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液做為空白對(duì)照。（2）加入0.1 mL MTT于37C孵育4 h。使MTT還原為藍(lán)紫色甲贊結(jié)晶。（3）加入150ul/孑L的DMSO,搖床上低速震蕩15min，使藍(lán)色的結(jié)晶充分溶解后，在酶標(biāo)儀上在OD值490nm處檢測(cè)（4）計(jì)算細(xì)胞成活率，繪制細(xì)胞生長曲線。2.7細(xì)胞形態(tài)觀察并記錄利用倒置相差顯微鏡觀察生長過程中細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。2.8 CCK8、MTT檢測(cè)關(guān)黃柏血中移行成分抗前列腺癌活性2.8.1.收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.8.2.5%CO2, 37C孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平