1、實(shí)驗(yàn)二、哺乳動(dòng)物組織DNA的快速分離與基因的PCR擴(kuò)增1一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解真核細(xì)胞中基因組結(jié)構(gòu)與組成的復(fù)雜性；學(xué)會(huì) 并掌握從哺乳動(dòng)物組織中提取基因組總DNA的原理 與技術(shù)，為PCR分析，RFLP分析，基因文庫的構(gòu) 建，基因探測(cè)等的研究打下基礎(chǔ)；2、學(xué)習(xí)與掌握PCR擴(kuò)增基因的原理和操作方法，了解 PCR基因擴(kuò)增技術(shù)在分子克隆，目的基礎(chǔ)檢測(cè)，遺 傳病的基因診斷，法醫(yī)學(xué)，考古學(xué)等方面的應(yīng)用。2二、實(shí)驗(yàn)原理1、哺乳動(dòng)物組織DNA的提取：在EDTA（鰲合二價(jià)陽離子以抑制DNase）存在的情況下，用蛋白酶K消化真核細(xì)胞或組織，用去垢劑如SDS溶解細(xì)胞膜并使蛋白質(zhì)變性。核酸通過有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提純化。污染

2、的RNA通過RNase消化去除。根據(jù)本方法制備的哺乳動(dòng)物DNA約2050 kb，適于作PCR反應(yīng)的模板。DNA產(chǎn)量在0.53.0g/mg組織之間。2、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)簡(jiǎn)稱技術(shù)：技術(shù)實(shí)際上是在模板， 引物和種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于聚合酶的酶促合反應(yīng)，技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。 反應(yīng)分三步：變性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（ex tension），反應(yīng)過程見圖。3模板DNA在94條件下變性形成單鏈； 在55條件下根據(jù)目的基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)的引物分別與其同源序列結(jié)合；70下在耐熱性DNA聚合酶T

3、aq 酶催化下， 在種dNTP存在條件下延伸形成雙鏈。完成一次循環(huán)。 接著又以新合成的DNA為模板進(jìn)行同樣反應(yīng)，如次往復(fù)循環(huán)30次，由于每次循環(huán)目標(biāo)DNA都以n次冪擴(kuò)增，30次循環(huán)后目的DNA的量增加1067倍。成功的PCR反應(yīng)要求反應(yīng)有很好的特異性，和相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增效率。 要達(dá)此目的PCR反應(yīng)要注意以下問題：、 DNA模板：反應(yīng)中DNA量在50ng200ng左右。且DNA純度 較高，以增加反應(yīng)特異性。、dNTP:反應(yīng)體系中達(dá)100M200M。4、Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq 酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低；、引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計(jì)。引物約20

4、堿基左 右，含量在40 70之間，引物內(nèi)部不能有回文 序列，引物端不能互補(bǔ)；、Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶， 在95時(shí)30 min還有50活力； 、變性溫度：在9395之間使模板充分變性。 、復(fù)性溫度：55左右，此溫度選擇是根據(jù)模板和引物配 對(duì)結(jié)合強(qiáng)弱而定， 它是反應(yīng)特異性的決定因素。、延伸溫度：7072左右，為Taq酶最適反應(yīng)溫度。5三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)儀器與材料： 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，恒溫水浴，真空泵，PCR儀，臺(tái)式冷凍離心機(jī)、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，冰箱、微量移液器、組織勻漿及，制冰機(jī)，一次性使用塑料手套和乳膠手套，豬肝組織。2、實(shí)驗(yàn)試劑

5、： 細(xì)胞裂解緩沖液：10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA (pH 8.0), 0.1% SDS，70% 乙醇，異丙醇，醋酸鉀(pH=4.8) ( 60ml的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5 ml H2O)，TE (pH 8.0)或無菌水，無DNase的RNase A (10mg/ml)，蛋白酶K(20 mg/ml)； TaKaRa Taq (5U/ l)，10PCR Buffer (Mg2+ Plus)，dNTP Mixture (each 2.5 mM)，豬肝基因組DNA，引物（Forward primer and Reverse prime

6、r)。6四、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）、豬肝組織DNA的抽提1、切下10-20 mg 組織，在液氮中碾磨成粉末。2、將粉末轉(zhuǎn)入1.5 ml 離心管中，加0.6 ml 細(xì)胞裂解 緩沖液和3 l 蛋白酶K，混勻，置于55 水浴中3 h 以上,但不要超過16 h。3、消化液降至室溫，然后加入 2 l無DNase的RNase A，混勻。37 水浴中放置0.5 h。4、將樣品降至室溫，加入 200l 醋酸鉀溶液，劇烈震蕩20 s使其充分混合。冰上放置5 分鐘。5、12000 rpm 離心 5分鐘 （4 ）。76、將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管中，加0.6 ml 異丙醇。 充分混勻， 12000 rpm 離心 5分鐘

7、 （4 ）。7、去掉上清，加入0.6 ml 70% 乙醇。顛倒離心管數(shù)次， 12000 rpm 離心 1分鐘（4）。8、去掉上清，空氣中干燥 DNA沉淀 15分鐘。9、將DNA沉淀溶解于 100 l TE 或水中。10、濃度和純度測(cè)定： OD260/OD280= 1.8-2.0； 1 OD260= 50 g/ ml（二）、PCR擴(kuò)增基因片斷：81、設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)程序 94預(yù)變性2 min后開始以下循環(huán) 94 30 sec 49 30 sec 20 cycles 72 30 sec 72 5 min； 4 冷卻恒定。92、在0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分： ddH2O: 19.9 l 10buffer: 2.5 l dNTPs(2.5 mM) 0.5 l Forward primer (10M) : 0.5 l Reverse primer (10M) : 0.5 l Taq DNA 酶(5U/l) : 0.1 l Template DNA(20ng/ l): 1.0 l 總體積 25 l103、混勻后，離心2-3秒，將PCR薄壁管放入PCR儀的 樣品槽中，選擇預(yù)先設(shè)定的程序，按START鍵啟動(dòng) PCR儀。4、采用1.2瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引 物擴(kuò)增的特異性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 1、提取的豬肝DNA進(jìn)行電泳后，采用凝膠成像系統(tǒng) 進(jìn)行拍照并對(duì)電泳圖譜進(jìn)