1、高效液相色譜講座河南省食品藥品檢驗(yàn)所 2009-05-311液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況 色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究植物葉子的組成時(shí)所用的一種方法。他用碳酸鈣作吸附劑，分離植物干燥葉子的石油醚萃取物。他把干燥的碳酸鈣粉末裝到一根長(zhǎng)的玻璃管中，然后把植物葉子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸鈣上，萃取液的色素就吸附在管內(nèi)上部的碳酸鈣里，再用純凈的石油醚洗脫被吸附的色素，于是在管內(nèi)的碳酸鈣上就形成了三種顏色的6個(gè)色帶。2液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況當(dāng)時(shí)，茨維特把這種色帶叫做色譜(Chromatography)，色譜法因之得名。在這一方法中，把玻璃管叫做“色譜柱”，碳酸鈣叫做“固定相

2、”，純凈的石油醚叫做“流動(dòng)相”。這就是最早的液固色譜法。后來(lái)在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。 3石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906 年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。4色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分，經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，那么在固定相中滯留的時(shí)間就不同，故從固定相中流出的先后也就不同。這種方法被稱為色層法、層析法。 5色譜分離過(guò)程Tempo

3、ral course流動(dòng)相6液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。 7液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度

4、快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。 8HPLC系統(tǒng) 一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。 910高效液相色譜儀( HPLC)目前常見(jiàn)的HPLC儀生產(chǎn)廠家國(guó)外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國(guó)內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析

5、儀器廠等。 11美國(guó)Agilent美國(guó)Waters12美國(guó)戴安日本島津美國(guó)VARIAN 日本島津13 Waters高效液相色譜儀14 日本島津高效液相色譜儀15開機(jī)前的準(zhǔn)備工作1、將試驗(yàn)要求的流動(dòng)相配制好。2、流動(dòng)相要過(guò)濾脫氣。3、裝好試驗(yàn)要求的色譜柱。1617流動(dòng)相:溶劑的沸點(diǎn)和粘度低沸點(diǎn)的溶劑通常其粘度低，但它在泵中易形成氣泡而影響泵的精度，還因易蒸發(fā)而改變混合流動(dòng)相的組成。高沸點(diǎn)的溶劑通常會(huì)因其粘度而降低柱效。對(duì)于有締合傾向的溶劑（特別是水和乙腈，水和甲醇），它們的粘度隨組成的變化是不規(guī)律的。例如：水：乙腈（35：65），水：甲醇（50：50）時(shí)，其粘度最大。18開機(jī)前的準(zhǔn)備工作流動(dòng)相要

6、過(guò)濾:以除去其中的微粒物質(zhì)。濾 膜：(0.45m)脂溶性濾膜（有機(jī)濾膜），水溶性濾膜，通用型濾膜(聚四氟乙烯能適用于所有溶劑)。HPLC級(jí)溶劑（色譜純）使用時(shí)不必再過(guò)濾了，因生產(chǎn)工藝中已用0.2m的過(guò)濾裝置過(guò)濾過(guò)了。19開機(jī)前的準(zhǔn)備工作脫 氣：為了防止在泵中、流路中、及檢測(cè)器中產(chǎn)生氣泡，而影響泵不穩(wěn)定性（使流速不穩(wěn)）和增加檢測(cè)器的噪聲，流動(dòng)相必須脫氣?；旌狭鲃?dòng)相比純?nèi)軇└苋芙饪諝猓瑯O易飽和形成氣泡，有水的流動(dòng)相特別明顯。脫氣方法：氦氣脫氣，真空脫氣（用真空過(guò)濾流動(dòng)相脫氣，在線脫氣機(jī)脫氣）， 超聲脫氣， 加熱脫氣。以不使流動(dòng)相中混合物濃度發(fā)生變化為原則。20貯液瓶貯液瓶是用來(lái)裝流動(dòng)相的容器，里

7、面還含有一個(gè)不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器。泵進(jìn)液管路一般用聚四氟乙烯管。不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器套在進(jìn)液管路上，有兩個(gè)功能：一是防止微粒物質(zhì)進(jìn)入泵，二是作為進(jìn)液管路的重物，所以常被稱為“沉子”。貯液瓶如被污染了可能會(huì)阻塞過(guò)濾片，影響泵的性能(使流速不穩(wěn))，出雜峰或產(chǎn)生噪聲。21反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為極性強(qiáng)的水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。 22反相色譜柱以硅膠為基質(zhì)的液相色譜填料多為反相柱，正相柱不太多。常用硅膠

8、健合C18、C8等填料柱。對(duì)硅膠做堿性脫活的反相柱（在高溫下硅烷化封閉硅羥基），（這類填料對(duì)堿性物質(zhì)如對(duì)胺有很小的吸附性）。高穩(wěn)定性反相柱（這種柱可以經(jīng)過(guò)酸和堿的作用）。23硅膠為基質(zhì)的一些缺點(diǎn)：在堿性介質(zhì)中（pH8）不穩(wěn)定。在孔隙中大分子擴(kuò)散困難，降低柱效。硅膠表面上的剩余硅羥基有離子交換作用。24反相色譜法中應(yīng)注意：盡量不使用乙酸鹽緩沖溶液，因?yàn)樗蛶ш?yáng)離子的溶質(zhì)會(huì)形成非極性絡(luò)合物。不使用鹵化物，以免腐蝕液相色譜儀。對(duì)水的質(zhì)量要求很高。一般應(yīng)用新鮮的高純水。樂(lè)百氏也可以用。每次試驗(yàn)用水都應(yīng)更換新鮮的水，因水易變質(zhì)，不能長(zhǎng)時(shí)間不更換。25正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相

9、)；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。 常用的有硅膠柱。 26反相HPLC 極性:固定相 流動(dòng)相 固定相 - 極性強(qiáng) 流動(dòng)相(己烷, 庚烷)- 極性弱 極性小物質(zhì)先出峰正相色譜 20%反相色譜80%正相色譜 20%反相色譜80%主流固定相與流動(dòng)相27物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑鍵合類型碳覆蓋率封端 化學(xué)性質(zhì)固定相-填充材料28物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度固定相-填充

10、材料29鍵合類型碳覆蓋率封端 化學(xué)性質(zhì)固定相-填充材料3031固定相-填充材料32色譜柱常用的pH值:隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5（28），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.510范圍操作。33色譜柱34色譜柱35開機(jī)順序：1、打開主機(jī)，檢測(cè)器，色譜工作站等電源開關(guān)。2、將配制好的流動(dòng)相放入流動(dòng)相通道內(nèi)，旋開排液（或灌液）旋鈕，將流動(dòng)相管路中存放的老溶劑替換掉。3

11、、關(guān)上排液（或灌液）旋鈕，逐漸將流速升高。平衡至少30分鐘后準(zhǔn)備進(jìn)樣。36替換掉管路中存放的老溶劑37替換掉管路中存放的老溶劑38進(jìn)樣前準(zhǔn)備樣品過(guò)濾一次性注射器針式（頭）過(guò)濾器樣品瓶39 六通閥/定量環(huán)進(jìn)樣器40儀器：手動(dòng)進(jìn)樣器-六通閥/定量環(huán)41手動(dòng)進(jìn)樣器工作原理 裝填狀態(tài)樣品注入42手動(dòng)進(jìn)樣器4344液相色譜中，用定量環(huán)進(jìn)樣時(shí)，注射器的抽取量不得少于環(huán)容積的5倍 。 45儀器：檢測(cè)器46UV/Vis雙燈，全波長(zhǎng)檢測(cè)檢測(cè)器流路儀器：檢測(cè)器-紫外47反射鏡1反射鏡2氘燈光源透鏡濾光片（鈥玻璃/遮光）入射狹縫光柵分光器參比光電二極管數(shù)模轉(zhuǎn)換板樣品光電二極管數(shù)模轉(zhuǎn)換板流通池紫外檢測(cè)器工作原理Agi

12、lent 1100 可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(G1314A)4849熒光檢測(cè)器50蒸發(fā)光檢測(cè)器51質(zhì)譜檢測(cè)器525354基本概念和術(shù)語(yǔ) 色譜圖(chromatogram)樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)?；€(base line)經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。噪音(noise)基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或

13、固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移 55基本概念和術(shù)語(yǔ)色譜峰(peak)組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見(jiàn)。峰底基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高(peak height，h)峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。 56基本概念和術(shù)語(yǔ)峰寬（peak width，W)峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W4半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)峰高一半處的峰寬。Wh/22.355峰面

14、積(peak area，A)峰與峰底所包圍的面積。保留時(shí)間(retention time，tR)從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。 57基本概念和術(shù)語(yǔ)理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。分離度(resolution，R)相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R1.5稱為完全分離。中國(guó)藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5。58理論塔板數(shù)(N)59分離度(R)60基本概念和術(shù)語(yǔ)拖尾因子(tailing factor，T)用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子(symmetry factor

15、)或不對(duì)稱因子(asymmetry factor)。中國(guó)藥典規(guī)定T應(yīng)為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。6162定性或定量通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間的一致性來(lái)進(jìn)行定性。定量常用:a:外標(biāo)法b:內(nèi)標(biāo)法63液相色譜分離定量常用的基本公式a:外標(biāo)法 含量（ C X ）= C R AX /AR CX為供試品濃度 AX為供試品峰面積 CR為對(duì)照品濃度 AR為對(duì)照品峰面積64液相色譜分離定量常用的基本公式b:內(nèi)標(biāo)法 校正因子（f）= AS CR /CS AR 含量（ C X ）= f AX CS /AS AX為供試品峰面積 CX為供試品濃度 AR為對(duì)照品峰面積 CR為對(duì)照品濃度 AS為內(nèi)

16、標(biāo)峰面積 CS為內(nèi)標(biāo)濃度65對(duì)儀器的一般要求 :除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。 正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。66報(bào)告書書寫內(nèi)容：檢品名稱：*片 批 號(hào)：200702016檢驗(yàn)項(xiàng)目：中國(guó)藥典2005年版二部附錄 D標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：含*應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%110.0%儀器編號(hào)：YQ .H . 測(cè)定日期： 室溫： 色譜柱編號(hào)：色譜柱規(guī)格：4.6mm250 mm色 譜

17、柱：固定相C18 柱 溫：25 檢 測(cè) 器：紫外檢測(cè)器 檢測(cè)波長(zhǎng)： 260nm 流 動(dòng) 相：水乙腈（6040）流速：1 ml/min 進(jìn) 樣 量：20 l67報(bào)告書書寫內(nèi)容：理論板數(shù)規(guī)定值：按*峰計(jì)算不低于1000 測(cè)定值：分離度規(guī)定值：大于1.5 測(cè)定值：對(duì)照品名稱：* 對(duì)照品批號(hào)：123-200701對(duì)照品來(lái)源：中國(guó)藥品生物制品檢定所68報(bào)告書書寫內(nèi)容：試驗(yàn)方法試驗(yàn)計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)論69HPLC日常維護(hù)總結(jié)70一、定期檢查溶劑過(guò)濾器查看過(guò)濾器是否變色臨時(shí)取下過(guò)濾器，檢查柱前壓力是否正常清潔溶劑過(guò)濾器將堵塞的溶劑過(guò)濾器從瓶頭組件中拿下。先用水沖洗殘留之溶劑，然后將過(guò)濾器放在裝有濃硝酸 （3

18、5）的燒杯里浸一小時(shí)，不要使用超聲波清洗。用二次蒸餾水徹底沖洗過(guò)濾器。建議不使用超聲波清洗機(jī)清洗。將過(guò)濾器重新裝好。71一、定期檢查溶劑過(guò)濾器建議定期清洗溶劑過(guò)濾器及溶劑瓶，每三個(gè)月至少清洗一次。注意：不要使用沒(méi)有安裝溶劑過(guò)濾器的系統(tǒng)可能會(huì)嚴(yán)重堵塞系統(tǒng).72日常維護(hù)流動(dòng)相應(yīng)經(jīng)過(guò)0.45um或更小孔徑的濾器過(guò)濾，如果使用濾膜，注意有機(jī)膜與水膜的區(qū)別(聚四氟乙烯能適用于所有溶劑)注意不同檢測(cè)器流通池耐壓?jiǎn)栴}，盡量避免使用pH9.5的流動(dòng)相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動(dòng)相，防止流通池堵塞73使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問(wèn)題？如果經(jīng)常需

19、要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無(wú)需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長(zhǎng)度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。 使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會(huì)變脆。74使用PEEK管路和接頭需要注意什么問(wèn)題？另一個(gè)需要考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過(guò)3000psi）。使用PEEK接頭時(shí)則無(wú)需擔(dān)心接頭耐溶劑

20、性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。75如何預(yù)防液相泵的故障: 要保持泵的良好操作性能,必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項(xiàng)措施: 1) 用高質(zhì)量試劑和HPLC級(jí)溶劑； 2）過(guò)濾流動(dòng)相和溶劑； 3）脫氣； 4）每天開始使用時(shí)放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液； 5）不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中； 76高效液相色譜中常遇見(jiàn)的問(wèn)題及處理方法 77基線噪音大可能由那些原因引起 可能原因是：泵壓不穩(wěn)，流動(dòng)池有氣泡，流動(dòng)池被污染，對(duì)紫外檢測(cè)器可將

21、流動(dòng)池移走即可確認(rèn)。 色譜柱污染，系統(tǒng)管路污染。 燈能量不足，光學(xué)系統(tǒng)老化或污染，參數(shù)設(shè)計(jì)不合理。 外界因素影響，如電源，溫度和濕度，震動(dòng)，等。78峰面積重現(xiàn)性不好1. 首先觀察壓力是否穩(wěn)定，以及觀察峰面積變化是否有規(guī)律。 若壓力不穩(wěn)定，請(qǐng)檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時(shí)間不足夠，鹽濃度過(guò)高導(dǎo)致鹽析，主動(dòng)閥比例閥內(nèi)漏，等。 2. 若壓力穩(wěn)定但峰面積呈無(wú)規(guī)律變化，請(qǐng)檢查樣品是否足夠，確認(rèn)樣品的穩(wěn)定性，必要時(shí)重新配制。檢查進(jìn)樣閥是否漏液。等。 3. 若壓力穩(wěn)定且峰面積呈規(guī)律變化，多數(shù)為色譜柱未平衡好。79保留時(shí)間不穩(wěn)定1. 首先觀察保留時(shí)間是否有規(guī)律的變化，并同時(shí)觀察壓力是否穩(wěn)定，若壓力

22、穩(wěn)定而保留時(shí)間呈有規(guī)律變化，多數(shù)是色譜柱未平衡好，特別是含有的流動(dòng)相，需較長(zhǎng)的時(shí)間去平衡。2. 若壓力穩(wěn)定而保留時(shí)間無(wú)規(guī)律變化，請(qǐng)檢查溶劑過(guò)濾頭及真空腔是否有堵塞。再平衡色譜柱足夠時(shí)間，如仍然不佳，可更換一色譜柱。3. 若壓力不穩(wěn)定，請(qǐng)檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時(shí)間不足夠，鹽濃度過(guò)高導(dǎo)致鹽析，主動(dòng)閥比例閥內(nèi)漏，等。80一、 保留時(shí)間縮短 1.流速增加2.樣品超載3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度增加1.檢查泵,重新設(shè)定流速2.降低樣品量3.流動(dòng)相PH值保持在37.5 檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫81二、 保留時(shí)間延長(zhǎng) 1.流速下降2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度降低1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫82三、 出現(xiàn)肩峰或分叉 1.樣品體積過(guò)大2.樣品溶劑過(guò)強(qiáng)3.柱塌陷或形成短路