1、PAGE PAGE 15 第一章 層析技術(shù)(Layer-analise technique)一、概 述離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項(xiàng)技術(shù)。（一）原理在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)，當(dāng)結(jié)合陽離子基團(tuán)時(shí)，可換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素。在纖維素上結(jié)合了DEAE，含有帶正電荷的陽離子纖維素OC6 H14N+H，它的反離子為陰離子（如Cl-等），可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)陰離子進(jìn)行交換。當(dāng)結(jié)合陰離子基團(tuán)時(shí)，可置換陽離子，稱

2、為陽離子交換劑，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纖維素。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離子（纖維素OCH2COO一），其反離子為陽離子（如Na+等）,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽離子進(jìn)行交換。 溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相同時(shí)，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質(zhì)等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，但各種蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的程度有所差異，以白蛋白為最多，依次為球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，溶液的pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所

3、吸附；當(dāng)溶液的pH值低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陽離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液pH值發(fā)生改變，就會直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個(gè)分離開來。 交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機(jī)鹽離子（如NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)兩者同時(shí)存在于一個(gè)層析過程中，則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。當(dāng)Cl一的濃度大時(shí)，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng)Cl一濃度小時(shí)，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強(qiáng)度，一種是改變洗脫液的pH值。pH值增高時(shí)，抑

4、制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對陰離子交換劑的吸附。當(dāng)使用陰離子交換劑時(shí)，增加鹽離子，則降低pH值。當(dāng)使用陽離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。 （二）常用離子交換劑的種類與特性 1.離子交換纖維素 離子交換纖維素的種類很多，其種類與特性如表11所示。表1-1 離子交換劑的類型與特點(diǎn)交換劑名 稱（纖維素）作 用 基 團(tuán)特 點(diǎn)陰離子交換劑二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2 H4-N H2胍乙基強(qiáng)

5、堿性、極高pH仍有效陽離子交換劑羧甲基CM-O-CH2-COO最常用在pH4以上磷酸P-O- P O2用于低pH磺甲基SM-O-CH2-SO3磺乙基SE-O-C2H4-SO3強(qiáng)酸性用于極低pH在交換纖維素中，最常用的是DEAE纖維素和CM纖維素。由于劑型不同，其理化性質(zhì)和作用也有所差異。一般而言，微粒型要優(yōu)于纖維素型，因?yàn)槲⒘Ｐ褪窃诶w維素型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提煉而成。它的交換容量大，粒細(xì)、比重大，能裝成緊密的層析柱，要求分辨力高的實(shí)驗(yàn)可用此型纖維素（見表12）。表1-2 商品DEAE纖維素和C M纖維素的類型和特性纖維素形狀長度交換當(dāng)量（毫克當(dāng)量/克）蛋白質(zhì)吸附容量（mg /g牛血清白蛋白）床體積

6、（ml / g）pH 6.0pH 7.6DE-22改良纖維124001.00.14507.77.7DE-23改良纖維（除細(xì)粒）184004508.39.1DE-32微粒型（干）24636606.06.7DE-52微粒型（濕）24636606.06.3DE-11舊型號50250130與以上相應(yīng)型號同溶菌酶pH5CM-220.60.066007.77.7CM-236009.19.1CM-321 2606.86.7CM-521.00.11 2606.86.7離子交換纖維素的優(yōu)點(diǎn)為：離子交換纖維素為開放性長鏈，具有較大的表面積，吸附容量最大；離子基團(tuán)少，排列稀疏，與蛋白質(zhì)結(jié)合不太牢固，易于洗脫；具有良

7、好的穩(wěn)定性，洗脫劑的選擇范圍廣。2離子交換交聯(lián)葡聚糖 離子交換交聯(lián)葡聚糖也是廣泛使用的離子交換劑，它與離子交換纖維素不同點(diǎn)是載體不同，常用交聯(lián)葡聚糖的類型與特性見表1-3。表1-3 常用交聯(lián)葡聚糖的類型與特性類 型性 能離子基因反離子總交換容量（毫克當(dāng)量/g）DEAE-sephadexA-25弱堿性、陰離子交換劑DEAE+Cl3.50.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱堿性、陰離子交換劑QAE+Cl3.00.4QAE-sephadex A-50CM-A- sephadex 25弱堿性、陽離子交換劑CMNa+4.50.5CM- sephadex A-50SP-

8、sephadex A-25強(qiáng)堿性、陽離子交換劑SPNa+2.30.3SP- sephadex A-50 離子交換交聯(lián)葡聚糖有如下優(yōu)點(diǎn)：不會引起被分離物質(zhì)的變性或失活；非特異性吸附少；交換容量大。 離子交換葡聚糖的選用，一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般選A50和C50，而低分子量（30 000和高分子量200 000）均宜選用A25和C25。 （三）試驗(yàn)方法 陰離子交換劑與陽離子交換劑的裝柱和層析過程基本相同。交聯(lián)葡聚糖的預(yù)處理只需充分溶脹和平衡，不需要除去細(xì)粒碎片和酸堿處理。其他步驟也基本同離子交換纖維素。1劑型的選擇 根據(jù)蛋白質(zhì)在所用緩沖液pH值下帶

9、電荷的種類選擇，如pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，應(yīng)選陰離子交換劑，反之應(yīng)選陽離子交換劑。一般情況下，DEAE-纖維素用于分離酸性蛋白，而CM纖維素用于分離堿性蛋白質(zhì)。 下面以DEAE-纖維素操作為例，介紹試驗(yàn)方法2膨脹活化 此步的目的在于除去雜質(zhì)，暴露DEAE-纖維素上的極性基團(tuán)。DEAE-纖維素的用量則根據(jù)柱容積的大小和所需過柱樣品的量來決定。一般是1.0g DEAE-纖維素相當(dāng)于6ml8ml柱床體積。表14 分離的血清與所需DEAE纖維素量及其他條件的大致關(guān)系血清樣品量（ml）DEAE需用量（g）選層析柱規(guī)格（cm）選脫液量（ml）122125100150552122003001010220300

10、4002020237400800稱取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE纖維素干粉約需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不時(shí)攪拌。抽濾（以布氏漏斗加兩層濾紙或尼龍紗布抽濾），以蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液近中性為止，再將纖維素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同樣抽濾液至近中性。再將纖維素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同樣處理，洗至中性。3平衡 將DEAE纖維素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始緩沖液），靜止1h，不時(shí)攪拌，待纖維素下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復(fù)幾次至傾出液體的pH值與加入的PB液的pH值相近時(shí)為止。4裝柱

11、層析柱的選擇要大小、長度適當(dāng)。一般而言，柱長和柱直徑之比為101201，柱的內(nèi)徑上下要均勻一致。用前將層析柱在清潔液內(nèi)浸泡處理24h，然后依次用常水、蒸餾水、起始緩沖液充分洗滌。 裝柱時(shí)，先剪一塊圓形的尼龍紗布（直徑與層析柱內(nèi)徑一致），放入層析柱底部。將柱下端連接細(xì)塑料管，夾上螺旋夾。把層析柱垂直固定在三角鐵架上，倒入起始緩沖液至一半的柱高，除去死區(qū)及塑料管內(nèi)的氣泡。再將平衡的DEAE纖維素糊狀物沿管壁倒入柱中。注意不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡應(yīng)排除或重裝。擰開螺旋夾，使流速至1ml/5min，待緩沖液快接近纖維素面時(shí)，繼續(xù)倒入纖維素糊，同時(shí)用玻璃棒攪拌表面層，以免使兩次加入的纖維素形成分界層，通過

12、進(jìn)出緩沖液調(diào)節(jié)流量，也可通過塑料管的升降來控制，至柱床體積不變?yōu)橹?。剪一圓形濾紙（與柱內(nèi)徑大小一致），從柱的上端輕輕放入，使其沉接于纖維素床表面，以免在加樣時(shí)打亂纖維素層。裝好柱的柱面應(yīng)該是平整的，無傾斜，整個(gè)柱床內(nèi)無氣泡、不分層。繼續(xù)平衡，使流出液的pH值與流入液的pH值完全一致為止。5上樣 要層析的樣品首先必須用起始緩沖液（4）平衡過夜，中間可換液數(shù)次。將柱的上端打開，用吸管將纖維素柱上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進(jìn)入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂纖維素表層。擰開下端的螺旋夾，使樣品進(jìn)入交換劑中，快要進(jìn)完時(shí)，加1ml2ml緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。 樣

13、品的加量與DEAE纖維素有一個(gè)最適比的關(guān)系，超過這個(gè)比值，吸附就不完全，直接影響到分離的純度。經(jīng)過粗提的球蛋白50mg100mg，用干重約4g DEAE纖維素裝柱分離，可獲得理想結(jié)果。6洗脫 對于陰離子交換劑而言，洗脫的辦法是使pH逐漸降低，而離子濃度逐漸升高。一般的辦法，是穩(wěn)定一個(gè)因素而改變另一個(gè)因素洗脫。洗脫可采用分段洗脫和連續(xù)洗脫法，前者較實(shí)用，后者較準(zhǔn)確。表15 血清蛋白各成分的吸附與解吸的關(guān)系成 分等電點(diǎn)DEAE吸附能力解吸順序白蛋白4.95.65.17.3強(qiáng)弱 后 先表16 血清的分段洗脫成分NaCl濃度（Mol/L）0.01Mol/L PB（pH）洗脫部分0.0258.0IgG0

14、.0307.0IgG0.0407.0運(yùn)鐵蛋白、纖維蛋白原0.0606.5白蛋白、IgA0.1506.5IgM 白蛋白表17 各種Ig解脫吸附條件不加NaCl PB離子強(qiáng)度（Mol/L）pHIg其他0.018.0IgG 0.0258.0IgE 0.0357.0IgA 0.0405.9球蛋白0.105.8白蛋白0.405.24.5IgM球蛋白7洗脫液的收集 利用自動分步收集器收集，并以20%磺基水楊酸測試，當(dāng)?shù)鞍滓合聛頃r(shí)，開始分管收集，至無蛋白液為止。8交換柱的再生 將使用過的DEAE纖維素移入燒杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽濾并洗滌數(shù)次。如不立即使用，可加1/10 000的疊氮鈉防腐，

15、保存于4冰箱中。使用時(shí)，再以堿酸堿處理。二、凝膠層析凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過濾。具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣，商品名是sephadex型號很多，從G10到G200，它的主要應(yīng)用范圍是：分級分離各種抗原與抗體；去掉復(fù)合物中的小分子物質(zhì)。如除鹽、熒光素和游離的放射性同位素以及水解的蛋白質(zhì)碎片；分析血清中的免疫復(fù)合物；分子量的測定。 （一）原理 凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運(yùn)動時(shí)，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時(shí)，分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠

16、間幾乎是垂直的向下運(yùn)動，而分子量小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠孔內(nèi)進(jìn)行“繞道”運(yùn)行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達(dá)到分離的目的。 （二）葡聚糖凝膠的種類與性能 葡聚糖又名右旋糖酐，在它們的長鏈間以三氯環(huán)氧丙烷交聯(lián)劑交聯(lián)而成。葡聚糖凝膠具有很強(qiáng)的吸水性，交聯(lián)度大，吸水性小，相反交聯(lián)度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯(lián)度越大，吸水性越小，G值越大，交聯(lián)度越小，吸水性就越大，二者呈反比關(guān)系，G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據(jù)床體積而估算出葡聚糖凝膠干粉的用量。表18 Sephadex1的種類與特性型號分離范圍（分子量）吸水量（ml/g）最小溶脹時(shí)（h）2025 100

17、床體積（ml）/干凝膠（mg）G107001.00.13 123G151 5001.50.23 12.53.5G255 0002.50.23 146G50150020 0008.00.33 1911G753 00070 0007.50.524 11215G1004 00015 00010.01.072 11520G1505 000800 00015.01.5 72 12030G2005 00030 000020.02.072 13040G25、G50有四種顆粒型號：粗（100300）、中（50150）、細(xì)（2080）和超細(xì)（1040）。G75G200又有兩種顆粒型號：中（40120），超細(xì)（1

18、040）。顆粒越細(xì)，流速越慢，分離效果越好。表19 DEAE纖維素與Sephadex1比較項(xiàng) 目DEAE纖維素Sephadex交換量小較大非特異性吸附較大小分離純度較好好分離時(shí)間較粗較長應(yīng)用范圍較窄較寬預(yù)處理繁瑣方便（三）試驗(yàn)方法1凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。2凝膠的預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同型號的凝膠而定（見表110）。表110 凝膠量與型號和層析柱大小與規(guī)格及凝膠

19、用量層析柱規(guī)格凝膠的規(guī)格和用量（g）直徑（cm）高（cm）容量（ml） G25 G50G100 G2000.9159.52.510.60.30.93019521.20.60.960381042.51.21.620401042.51.21.640802085.02.41.67014035149.04.41.6100200502012.562.64021050201272.670370903520122.62.6100605301 0001302505011030701735 為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復(fù)數(shù)次即可。3裝柱 層析柱的

20、選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí)，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的410倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時(shí)間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過細(xì)，會發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對于除鹽來說應(yīng)為15125；對于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1201100。 裝柱過程基本同離子交換層析柱。4加樣與洗脫 樣品體積不宜過多，最好為床體積的15%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。 洗

21、脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0.020.1Mol/L pH 6.98.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。5洗脫液收集 同離子交換層析。6凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種： 在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4保存。此法至少可以保存半年以上。 用完后，以水沖洗，然后用60%70

22、%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。 長期不用者，最好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于6080干燥后保存。三、親和層析 （一）原理 親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達(dá)到分離提純的目的。 此法具有高效、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。 （二）載體的基本要求和選擇理想的載體應(yīng)具有下列基本條件：不溶于水，但高

23、度親水；惰性物質(zhì)，非特異性吸附少；具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化；理化性質(zhì)穩(wěn)定；機(jī)械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；通透性好，最好為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使大分子能自由通過；能抵抗微生物和醇的作用。 可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強(qiáng)。聚丙稀酰胺凝膠是目前的首選優(yōu)良載體。 瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不受細(xì)菌和酶的作用，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時(shí)，對蛋白質(zhì)幾乎沒有非特異性吸

24、附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化，活化后性質(zhì)穩(wěn)定，能經(jīng)受層析的各種條件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl處理2h3h及蛋白質(zhì)變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理，不引起性質(zhì)改變，故易于再生和反復(fù)使用。 瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。因?yàn)镾epharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用最廣。 （三）試劑與配制 1Sepharose 4B 2CNBr（劇毒） 3抗原或抗體 41Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。 50.1Mol/L NaH

25、CO3 62Mol/L NaOH 70.01Mol/L pH7.4 PBS 0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml 0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml NaCl 32.76g 加水至4 000ml。 80.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸HCl緩沖液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。 97Mol/L尿素 100.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI） 1Mol/L NaHCO3 100.00ml NaCl 2.93g 加水至500.00ml。 （四）實(shí)驗(yàn)方法

26、1瓊脂糖活化 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應(yīng)10min。在1min2min迅速調(diào)整pH為8.011.0維持10min。 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。2偶聯(lián)蛋白 20ml 4B液體相當(dāng)于一半的固相載體。 事先將需偶聯(lián)的抗原（或抗體）蛋白200mg置于

27、0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(shí)(一般偶聯(lián)量為1030mg/g載體)。 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內(nèi)，從抽洗到偶聯(lián)），4緩慢攪拌過夜，使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。3裝柱 選柱：不宜過大，一般以1.515cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。 裝柱：將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi)，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD2800.02為止。收集全部的洗脫液，測得的OD280值洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白

28、的含量，由此可計(jì)算偶聯(lián)率。4吸附與解吸附 按床體積1/10加樣，濃度為12%，緩慢加入待純化的抗體（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液OD2800.02為止。 加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。5以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入0.02%Na N3于4保存。防止冷凍和干裂。6結(jié)果判定 對解吸附下來的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進(jìn)行純度鑒定。 將

29、純度好的各管洗脫液合并，以生理鹽水透析，然后濃縮或凍干保存。四、氣相色譜層析 （一）基本原理 混合樣品的氣流通過固定相時(shí)，根據(jù)各組分對固定相的吸附強(qiáng)弱不同使不同成分得到分離。 利用氣相色譜層析技術(shù)做為微生物診斷的工具已成功地用于微生物的分類和鑒定。該法敏感性強(qiáng)，能夠分離和檢測到毫微克的水平。它具有快速的特點(diǎn)，常在數(shù)十分鐘甚至數(shù)小時(shí)就可以對傳染病做出早期診斷。其結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，但不足之處是操作中各因素不易控制，方法不易標(biāo)化等。 （二）氣相色譜儀的基本部件載氣 常用的載氣主要有氮、氬、氫和二氧化碳等。這些氣體一般都由高壓氣瓶供給。2 進(jìn)樣器 氣相色譜儀可以用于分離固相、氣相和液相標(biāo)本。液相標(biāo)本

30、采用微升注射器穿過橡皮隔片注入，氣相標(biāo)本采用特種氣相注射器注入。譜柱及加熱爐 色譜柱一般由金屬或玻璃制成，通常采用的柱長2m4m，內(nèi)徑2mm, 毛細(xì)管柱長度可達(dá)20m150m，內(nèi)徑為0.2mm。 載體一般采用惰性、多孔的固體顆粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同極性的微生物化合物，為了獲得最適的分離條件，要求有不同固定相的載體。目前比較常用的載體有：聚乙二醇（CarbOwax 20M）、F F A P（聚乙二醇20M和2-硝基對苯二甲酸的反應(yīng)產(chǎn)物），OV17（苯基甲基硅酮）。OV-210、SE-30（甲基硅酮）、Chromosorb G（白色硅藻土載體）等。柱加熱爐在溫度控制上是非常重要的。4

31、 紀(jì)錄儀5 數(shù)據(jù)處理裝置 一般均附有數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)。氣相色譜儀的基本流程圖如下圖1-1：進(jìn) 樣 器計(jì) 算 機(jī)載氣源閥門氣化室色譜柱檢測器紀(jì)錄儀圖1 氣相色譜儀的基本流程 （三）試驗(yàn)條件的選擇色譜柱的選擇 要注意極性及最高使用溫度，柱溫不能超過最高使用溫度。固定相按極性相似的原則選擇。 色譜柱的內(nèi)徑大小、長度都能影響分離率。一般而言，內(nèi)徑越小，長度越長，分離效果越好，一般柱長為1m5m（毛細(xì)管柱則20m100m）。 填充劑顆粒一般采用40目60目，60目80目及80目100目大小。長柱子宜用粒度大些的，以減少柱壓降，短柱子則用粒度細(xì)的。氣相色譜中固定液的含量對分離效率的影響較大。一般采用固定液與

32、載體重量之比為1510025100。采用高靈敏度的檢測器，由于進(jìn)樣量減少，固定液含量可以降至5100以下。這樣可以使用較低柱溫，從而提高柱效，縮短分析時(shí)間。但固定液用量太少會引起吸附。2柱溫選擇 柱溫選擇對分離度影響很大，常是條件選擇的關(guān)鍵。選擇的基本原則是：在使最難分離的組分有盡可能好的分離高度的前提下，盡可能采取較低溫度，但以保留時(shí)間適宜及不拖尾為度。 高沸點(diǎn)混合物（200400），若需在較低的柱溫下分析，可采用低固定液配比13%，采用高靈敏檢測器，柱溫可比沸點(diǎn)低100150，在200250的柱溫下分析。 沸點(diǎn)300的樣品，可用325%固定液配比。沸點(diǎn)越低，所用配比越高，柱溫可比平均沸點(diǎn)低

33、50至平均沸點(diǎn)的范圍選擇。3載體選擇 載體采用低線速時(shí)，宜用氮?dú)猓桓呔€速時(shí)用氫氣。柱越長，柱內(nèi)有較大壓力降，宜用氫氣。載氣采用低線速時(shí)為20ml80ml/min。4其它條件 氣化室溫度及檢測室溫度選擇：氣化溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點(diǎn)、穩(wěn)定性以及進(jìn)樣量，一般選擇稍高于樣品沸點(diǎn)，但不要超過沸點(diǎn)50%以上，以防分解。檢測室溫度需高于柱溫，一般高于柱溫30左右或與氣化室同溫。 進(jìn)樣量：固定相在配比1535%的層析柱時(shí)，最大進(jìn)樣量液體為10l，氣體為10ml。一般樣品量液體4l，氣體為0.5ml3ml，固體小于1mg。 橋電位選擇：散熱多和選擇大的橋電位，在靈敏度相同的情況下，應(yīng)盡量選擇低橋電位，以保

34、護(hù)熱敏元件。 （四）填充柱的制備1稱取一定量的載體于蒸發(fā)皿中，加2倍于載體體積的低沸點(diǎn)溶劑（氯仿丙酮、三氯甲烷等），使之溶解。2取適量的固定液，倒入蒸發(fā)皿中，拌勻。注意應(yīng)使載體全部覆蓋在液面下，于紅外燈下緩緩加熱，不時(shí)輕輕攪拌，待溶液全部揮發(fā)。3先將柱的一端用玻璃毛輕輕堵上，接上吸濾真空泵，柱的另一端接上漏斗，將填充劑從漏斗加入，同時(shí)啟動真空泵，不時(shí)輕敲柱子各部，以使填充均勻。裝滿后，關(guān)閉真空泵，取下色譜柱，將加樣的一端也填上一小團(tuán)玻璃毛。4將柱裝入色譜柱中，在通載氣前，先將爐溫升至略高于操作溫度，保持約1h，以使固定液受熱熔化或粘度減小，在載體表面流布均勻，然后再通入載氣，使色譜柱在操作溫度下，通載氣數(shù)小時(shí)。（五）樣品處理 以細(xì)菌培養(yǎng)物樣品的處理為例。1取35個(gè)菌落，接種于2ml含有3%葡萄糖TSB肉湯（