1、00總SOD活性檢測(cè)試劑盒(NBT法)產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱包裝S0107總SOD活性檢測(cè)試劑盒(NBT法)100次產(chǎn)品簡(jiǎn)介：碧云天的總SOD活性檢測(cè)試劑盒(NBT法TotalSuperoxideDismutaseAssayKitwithNET)是一種基于NBT的顯色反應(yīng)，通過(guò)比色來(lái)檢測(cè)細(xì)胞.組織或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒。超氧化物岐化(SuperoxideDismutase,SOD)能催化超氧化物陰離了發(fā)生岐化作用，生成過(guò)氧化氫(HQ)和氧氣(O)是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。本試劑盒采用經(jīng)典的氮藍(lán)四哇(NBT)顯色法。通過(guò)黃嚓吟(Xanthine)及黃嚓吟氧化幽(Xantlu

2、neOxidase)反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離了(O)，將氮藍(lán)四醴還原為藍(lán)色的川噴(fomuzcm),后者在560nm處有強(qiáng)吸收。而SOD可淸除超氧陰離了，從而抑制了甲噴的形成。反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明超氧化物岐化幽活性愈低，反Z則齣活性愈高。據(jù)此通過(guò)比色分析就可以計(jì)算出超氧化物岐化廨活性水平。本試劑盒的檢測(cè)原理圖如下：uricacidNBTformazanNBT00O2+H2O2基于黃瞟吟氧化幽痢聯(lián)反應(yīng)體系和NET的SOD腳活力檢測(cè)原理圖。XO：xanthineoxidase本試劑盒可以檢測(cè)細(xì)胞或組織的裂解液或勻漿液、全血.紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物、血清等生物樣品中的SOD活性。個(gè)試劑盒共可以進(jìn)行J00次檢測(cè)。

3、包裝清單:產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱包裝S0107-1SOD檢測(cè)緩沖液20nilS0107-2NBT500卩1S0107-3的溶液50plSO107-4稀釋液lOnil說(shuō)明書1份保存條件:4C保存，半年有效。SO107-2NBT溶液需避光保存。注意事項(xiàng)：樣本70C可保存1個(gè)月。需注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致部分SOD失活。抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生T擾，例tillO.lniMascorbicacid,5m2vlGSH都會(huì)使測(cè)定出來(lái)的吸光度上升約10%。此時(shí)盡管樣品沒(méi)有顏色，如果設(shè)置了使用說(shuō)明中的空口對(duì)照3,就可以消除樣品中的抗氧化物的T擾。酚溶液可能會(huì)有少量沉淀，屬正?，F(xiàn)彖，請(qǐng)混勻后使用。為了您的安全和健康，

4、請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。使用說(shuō)明：1.樣品的準(zhǔn)備：細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：收集細(xì)胞，用4CPES或生理鹽水洗滌12遍。沉淀用碧云天的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)裂解，或用具他適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀?，或進(jìn)行勻漿。對(duì)于裂解液或勻漿液，4C離心取上淸作為待測(cè)樣品。裂解或勻漿宜在冰浴或4C進(jìn)行操作。組織樣品的準(zhǔn)備：動(dòng)物紐織用生理鹽水(0.9%NaCl,含有0.16mg/nil肝素鈉)灌流淸除血液后獲取紐織樣品。取適量的組織樣品，加I入碧云天的Western及IP細(xì)胞裂解液（P0013）或具他適當(dāng)溶液進(jìn)行勻漿。對(duì)于勻漿產(chǎn)物，4C離心取上清作為待測(cè)樣品。裂解或勻漿宜在冰浴或4C進(jìn)行操作。紅細(xì)胞或血

5、漿樣品的準(zhǔn)備：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4Ceoog離心10分鐘，移取上清至另一新的lml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)。紅細(xì)胞樣品可同細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備，可以用碧云天的Western及IP細(xì)胞裂解液（P0013）或其他適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀狻Ｉ鲜鰳悠窚?zhǔn)備完畢后可以用碧云天生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0009/P0010.P001OS/POO11.POO12/P0012S）測(cè)定蛋匚1濃度。通常1020微克蛋匚I的細(xì)胞或組織裂解液或勻漿液樣品具中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右。每種樣品準(zhǔn)備20J00微克蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測(cè)。根據(jù)蛋I濃度和預(yù)計(jì)的蛋匚I使用量，用本

6、試劑盒提供的稀釋液適當(dāng)稀釋樣品。裂解好的樣品通常至少需要加入等體積的稀釋液進(jìn)行稀釋。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)日測(cè)定，可以冰浴保存，如果當(dāng)天不能完成測(cè)定，可以70C凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測(cè)定。2試劑盒的準(zhǔn)備工作：NBT工作液的配制：按照每1.8毫升SOD檢測(cè)緩沖液中加入50微升NBT的比例進(jìn)行配制（用SOD檢測(cè)緩沖液將NBT稀釋約36倍），混勻后即為NBT工作液。可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需耍配制適當(dāng)量的NBTT作液，配制好的NBTT作液4C可以保存12天，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。酶工作液的配制：先把試劑盒中的幽溶液輕輕混勻，并輕輕離心沉淀酶溶液至管底。按照每200微升稀釋液中加入5微升幽溶液的比例進(jìn)行配制（用稀釋液

7、將酶溶液稀釋約40倍），混勻后即為酚丁作液。可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需耍配制適當(dāng)量的卿工作液，配制好的腳工作液4C可保存12周，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酚溶液的用量比較少且易沉降，必須注意充分混勻。（可選做）SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：100U/1111,50U/1111,20U/1111.10U/D11,5U/1111,lU/ml,0.1U/nil,0.01U/ml,0.001U/mL在隨后的檢測(cè)中可以各取20微升，參考樣品進(jìn)行檢測(cè)。說(shuō)明：本試劑盒對(duì)于SOD的檢測(cè)并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照或作為對(duì)S

8、OD活性定量的參考。3樣品測(cè)定：a.參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對(duì)照孔。參考下表依次加入待測(cè)樣品和其他各種溶液。加入酚工作液后充分混勻。注意：加入酚工作液后反應(yīng)即會(huì)開(kāi)始，可以在低溫操作或用扌IF槍操作以減小各孔間因?yàn)榧尤胗墓ぷ饕旱臅r(shí)間先后而導(dǎo)致的誤差。樣品(Sample)空白對(duì)照l(shuí)（Blankl）空白對(duì)照2（Blank2）空白對(duì)照3（Blank3尸待測(cè)樣品20gl20gl稀釋液20gl40pl40glNBT工作液180pl180gl180pl180gl酶工作液20pl20gl興如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空匚I對(duì)照3：如果樣品沒(méi)有顏色并且也不含有抗氧化物則沒(méi)有必要設(shè)置空

9、白對(duì)照337C孵冇20分鐘。（說(shuō)明：孵育20分鐘至30分鐘檢測(cè)出來(lái)的SOD活力無(wú)顯著差異）在560mn測(cè)定吸光度。可以使用大于650mn的波氏作為參考波2進(jìn)行雙波氏測(cè)定。4樣品中總SOD活力的計(jì)算：抑制百分率的計(jì)算：參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率:抑制百分率=（A空白對(duì)A空翊nJ（A杠一A空Mm）/（A空白財(cái)出一A空白2）x100%如果沒(méi)有設(shè)置空口對(duì)照3,則可以把計(jì)算公式簡(jiǎn)化為：抑制白分率=叱一Anu）/（A空仙剛A叱白冊(cè)2）x100%如果計(jì)算出來(lái)的抑制白分率小于30%或人于70%,則通常需要把該樣品重新測(cè)定。盡量使樣品的抑制白分率在30-70%范圉內(nèi)。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀

10、釋樣品：如果測(cè)定出來(lái)的抑制白分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣品。SOD酚活力單位的定義：在上述黃喋吟氧化酚藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制白分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SODM活力定義為一個(gè)酶活力單位。SODIW活力的計(jì)算：0.02A806040OH04051015SOD離活力(units)円1000.015-0.01-0.0050.20.4O.e0.81丿$0D蔚活力(1/units)參考上圖A和E,SOD的齣活力和抑制白分率呈非線性的關(guān)系，而1/SOD酶活力和1/抑制白分率成線性關(guān)系。由此得出SOD酶活力的計(jì)算公式如下：待測(cè)樣品中SOD酶活力單位=檢測(cè)體系中SOD酶活力單位=抑制百分率/（1抑制

11、百分率）units例如當(dāng)抑制白分率為50%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酚活力單位=50%/（l-50%）umts=lunit：當(dāng)抑制白分率為00%時(shí)，待測(cè)樣品U|SOD廨活力單位=60%/（1C0%）units=1.5unitso如果樣品為細(xì)胞或組織的裂解液或勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋IX如果樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋匚1含量，可換算為U/克血紅蛋口或U/毫克血紅蛋白。附1：SOD腮活力計(jì)算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制白分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測(cè)到的抑制白分率對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制白分率曲線計(jì)算岀樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。附2：SOD腳活力的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：如果條件許可，使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)SOD的酚活力。