1、 附件3保健食品中巴比妥類化學成分的快速檢測膠體金免疫層析法（征求意見稿）1 范圍本方法規(guī)定了保健食品中巴比妥類化學成分的膠體金免疫層析快速檢測方法。本方法適用于硬膠囊、軟膠囊、丸劑、片劑、散劑及口服液等保健食品中巴比妥類化學成分的快速測定。2 原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的巴比妥類化學成分經(jīng)提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制了抗體和檢測線（T線）上抗原的結合，從而致使檢測線不顯色。通過檢測線的顯色與否判讀，對樣品中巴比妥類化學成分進行定性判定。3 試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。3.1 試劑3.1.1 無水乙醇。3.1

2、.2 提取液：將無水乙醇（3.1.1）與水按照體積比10:90混勻。3.1.3 甲醇。3.2 參考物質參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度95%。表1 參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量巴比妥Barbital57-44-3C8H12N2O3184.19苯巴比妥Phenobarbital50-06-6C12H12N2O3232.24異戊巴比妥Amobarbital57-43-2C11H18N2O3226.27司可巴比妥鈉Secobarbital76-73-3C12H17N2O3238.2

3、8注：或等同可溯源物質。3.3 標準溶液的配制3.3.1 巴比妥類標準儲備液（0.5 mg/mL）：精密稱取巴比妥（或苯巴比妥，異戊巴比妥，司可巴比妥鈉）標準品（3.2.1）適量，置于10mL容量瓶中，加入適量甲醇（3.1.3）超聲溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.5mg/mL的巴比妥類標準儲備液。20 避光保存，有效期6個月。3.3.2 巴比妥類標準中間液（50g/mL）：精密量取巴比妥類標準儲備液（0.5mg/mL）（3.3.1）1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為50g/mL的巴比妥類標準中間液。3.4材料免疫膠體金免疫層析試劑盒，適

4、用于保健食品硬膠囊、軟膠囊、丸劑、片劑、散劑及口服液。4 儀器和設備4.1天平：感量為0.01 g。4.2渦旋混合器。4.3移液器：200L4.4離心機：轉速4000r/min。4.5環(huán)境條件：溫度1535，濕度80%。5 分析步驟5.1試樣制備取適量樣品，硬膠囊及軟膠囊取內(nèi)容物充分混勻，丸劑及片劑充分粉碎混勻，散劑及口服液充分混勻。5.2試樣提取準確稱取試樣2.0 g（精確至0.01g）于15mL具塞離心管中，加入10mL提取劑（3.1.2）。加蓋后振搖或渦旋振蕩0.5min，放置至澄清（30min內(nèi)）或4000r/min離心5min，取上清液作為待測液。5.3 測定步驟吸取200 L待測液

5、滴加到檢測卡（3.4.1.1）上的加樣孔中，開始計時。38min內(nèi)觀察質控線（C線）和檢測線（T線）的顯色情況，進行結果判定。5.4 質控試驗每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。5.4.1 空白試驗稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。5.4.2 加標質控試驗準確稱取空白試樣（精確至0.01g）置于15mL具塞離心管中，加入一定體積的巴比妥類標準中間液（3.3.2），使巴比妥類化學成分添加濃度為：巴比妥40mg/kg（或苯巴比妥40mg/kg，異戊巴比妥60mg/kg，司可巴比妥鈉60mg/kg）。按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。6 結果判定通過對比控制線（C線）和檢

6、測線（T線）的顏色深淺進行結果判定。目視判定示意圖見圖1。6.1 無效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或檢測卡無效。6.2 陰性結果檢測線（T線）和控制線（C線）均顯色，表明樣品中巴比妥類化學成分低于方法檢測限，判定為陰性。6.3 陽性結果檢測線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中巴比妥類化學成分的含量高于方法檢測限，判定為陽性。 陰性（-） 陽性（） 無效圖1 檢測結果判讀6.4 質控試驗要求空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。7 結論當檢測結果為陽性時，應對結果進行確證。8 性能指標8.1 檢測限：巴比妥40mg/kg、苯巴比妥40mg/kg、異戊巴比妥6

7、0mg/kg、司可巴比妥鈉60mg/kg。8.2 靈敏度：靈敏度應96%。8.3 特異性：特異性應98%。8.4 假陰性率：假陰性率應4%。8.5 假陽性率：假陽性率應2%。8.6 相對準確度：相對準確度應96%。注：性能指標計算方法見附錄A。9其他本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規(guī)定的各項性能指標。本方法參比標準為國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（批準件編號2009024）和保健食品中75種非法添加化學藥物的檢測BJS 201710。附錄

8、A定性方法性能計算表表A.1 性能指標計算方法樣品情況a檢測結果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(c2)c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果；b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。N：任何特定單元的結果數(shù)，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列