1、2018-5-14檢驗科臨床PCR檢驗標(biāo)本的處理、保存及核酸提取方法腫病瘤原分新個體子產(chǎn)生體核遺前兒化酸傳診篩檢檢檢斷查測測測唐羊無四新新液組性乙呼藥耳氏水創(chuàng)病生生態(tài)織病肝吸物染聾煙臺市煙臺山醫(yī)院檢驗科崔金鵬色篩細(xì)產(chǎn)篩兒兒活檢三等道代基項病謝體因查胞前查耳遺檢測原酶微檢核聾傳體檢缺測型基代失分因謝測篩析檢病查測篩查病人識別病人準(zhǔn)備設(shè)備校準(zhǔn)PCR擴(kuò)增性能評價精密性重復(fù)性攜帶污染標(biāo)本采集采集質(zhì)量評價標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本評價標(biāo)本保存核酸提取質(zhì)量評價實驗室外l 血清（漿）l 全血結(jié)果評價報告發(fā)放指導(dǎo)診斷l(xiāng) 痰實驗室內(nèi)l 拭子l 膿液Analytical Phase Post-analyticall 體液l 干

2、血片l 組織l 骨髓穿刺樣本/細(xì)針穿刺細(xì)胞常規(guī)項目ll對于DNA測定的標(biāo)本，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對測定影響不大。對于RNA測定的標(biāo)本（如HCV），抗凝后6小時內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時內(nèi))分離血清，72h內(nèi)提取RNA則可放置在4下。標(biāo)本的短期（15天內(nèi)）保存可在-20下，較長期保存應(yīng)在-70下。ll抗凝劑不能有肝素盡快分離血漿是核酸不被降解的關(guān)鍵步驟。室溫下不同保存時間對血清 HCV-RNA檢測的影響較小12018-5-14血清反復(fù)凍融對HCV-RNA檢測的影響較小不分離血清對弱陽性標(biāo)本 HCV-RNA檢測的影響較大Circulating cell-free DNA

3、SerumSerumEDTA-plasmaEDTA-plasma內(nèi)源性DNase活性測定外源性DNase I的降解能力Circulating cell-free DNABRAF A1/A2-105bpBRAF A1/B2-288bp反復(fù)凍融血漿2次以上對cfDNA影響較大22018-5-14Circulating cell-free DNA全血保存于Streck采血管3天后分離血漿Circulating cell-free DNA1. 使用EDTA抗凝采血管，不能使用肝素 ;2. 檢測樣品應(yīng)為血漿而非血清，避免標(biāo)本反復(fù)凍融；3. 采血后混勻動作要輕柔 ;4. 如果不能及時處理應(yīng)使用專用采血管，

4、 標(biāo)本運(yùn)送時常溫運(yùn)送；5. 應(yīng)根據(jù)試劑或試管的說明書進(jìn)行必要的調(diào)整。l 全血標(biāo)本主要是提取單個核細(xì)胞中的核酸：基因組DNA、線粒體DNA和總RNA等l 單個核細(xì)胞的制備途徑：1. 使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備2. 使用紅細(xì)胞裂解液裂解全血中的紅細(xì)胞，再經(jīng)過生理鹽水洗滌即可得到白細(xì)胞l 單個核細(xì)胞如果不提取核酸，可保存于 -70。l 嚴(yán)禁反復(fù)凍融，如果不能保證低溫則應(yīng)使用專用采血管l 需要提取細(xì)胞內(nèi)總RNA的標(biāo)本，應(yīng)迅速保存于 -70下，否則應(yīng)使用含有RNA保護(hù)成分的專用采血管保存。室溫保存不同時間對RNA總量的影響不同溫度保存對RNA總量的影響32018-5-14全血-循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞富

5、集技術(shù)稀有性抗原特異性非典型形態(tài)陰陽性富集技術(shù)比較陽性富集陰性富集lll用PCR方法檢測性病病原體時（衣原體、支原體、淋球菌、梅毒螺旋體、HPV和流感病毒等）臨床標(biāo)本一般為拭子。CTC標(biāo)本取材是關(guān)鍵，衣原體等病原體感染上皮細(xì)胞，因此取材一定要取到細(xì)胞。白細(xì)胞磁珠處理時將拭子置于適量的生理鹽水中，充分震蕩洗滌后，室溫靜止 5-10分鐘，取上清，離心后的沉淀，經(jīng)生理鹽水洗滌一次后，沉淀可用于核酸提取免疫染色l使用具有細(xì)胞保護(hù)液的專用保存管保存樣本。42018-5-14粘稠膿液水樣膿液ll臨床標(biāo)本置于經(jīng)過處理的濾紙片上，如靶核酸為 DNA，可室溫保存數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為 RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。分枝

6、桿菌非分枝桿菌直接離心同痰液加入適量生理鹽水保存在濾紙上的標(biāo)本，保存時間長，還可因為標(biāo)本中的 PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對后面的擴(kuò)增檢測造成影響。震蕩，靜置取上清后離心沉淀沉淀沉淀ll不管是全血、血清（漿），還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。采血后，室溫靜置4小時，血片徹底干后再保存。核酸提取RNA穩(wěn)定和儲存溶液l經(jīng)典方法原理：短時間內(nèi)迅速滲入細(xì)胞，特異性抑制細(xì)胞內(nèi)的Rnase活性，從而保證RNA的完整性。l煮沸法商品化試劑盒注意：a. 使用前標(biāo)本不能冷凍；ll硅吸附法磁珠法b. 將組織切成任一方向小于 5mm的薄片，并浸于約5倍體積的RNAlater溶液中

7、；c. 細(xì)胞標(biāo)本使用RNAlater時需要注意；d. 如果要保存在-20或者-80則需要先在4過夜對其核酸提取的有效性進(jìn)行評價材料準(zhǔn)備破碎細(xì)胞核酸釋放與純化AC優(yōu)點：提取的DNA純度高沉淀或吸附核酸，進(jìn)一步純化核酸溶解于緩沖液或水中缺點：操作復(fù)雜DNA損失嚴(yán)重不適于模板量較小的標(biāo)本52018-5-14應(yīng)用： 質(zhì)粒提取小分子量環(huán)狀DNA問題：病原體DNA的提取時所使用煮沸法與質(zhì)粒提取時所使用的煮沸法是否相同？原理：1. 血清等溶液在加熱處理后蛋白質(zhì)和 DNA均會變性不同，主要區(qū)別如下：2. 線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的 DNA雖然也會變性，但冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象1. 病原體基因組DNA遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA2. 提取病原體DNA時的煮沸是為了將病原體 DNA和蛋白質(zhì)徹底變性，將其基因組DNA釋放到溶液中，煮沸時間較長一般為 10min，而提取質(zhì)粒時煮沸7：完整性較好6-7：部分降解6：完整性較差RNA完整性的影響因素室溫條件下，全血細(xì)胞RNA的完整性受到破壞純DNAOD260/OD280=1.8一般1.8-2.0之間純RNAOD260/OD280=2.0一般1.9-2.1之間92018-5-14OD320：主要反映溶液的濁度，其值應(yīng)該為 0，其吸光度通常作為baseli