1、 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)Experiment of Medical Microbiology 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 楊致邦 2014.5. 教材高等醫(yī)學(xué)院校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)系列教材 病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 科學(xué)出版社，2013年8月第二版 主編 楊致邦 葉彬1.強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室生物安全觀念，無(wú)菌操作技術(shù)；2.掌握病原生物學(xué)的基本方法與基本操作技術(shù);3.加深對(duì)病原微生物學(xué)基本理論知識(shí)的理解與認(rèn)識(shí)；4.培養(yǎng)獨(dú)立操作、獨(dú)立觀察和思考、獨(dú)立分析問題和解決實(shí)際問題的能力；5.培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)、科學(xué)的方法和嚴(yán)肅認(rèn)真的工作態(tài)度。 實(shí)驗(yàn)教學(xué)的目標(biāo):實(shí)驗(yàn)成績(jī)的評(píng)定：免疫學(xué)+

2、寄生蟲學(xué)+微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成績(jī)；平時(shí)成績(jī)：30%，考試成績(jī)：70% ；平時(shí)成績(jī)：實(shí)驗(yàn)課上課情況+實(shí)驗(yàn)報(bào)告；考試：最后一次課。臨床醫(yī)學(xué)本科實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排周次實(shí)驗(yàn)課的帶教內(nèi)容學(xué)時(shí)數(shù)顯微鏡錄像11細(xì)菌形態(tài)觀察 4需要12細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象與消毒滅菌 4有13致病性球菌 4需要有14腸道桿菌 4有15白喉?xiàng)U菌、厭氧菌4需要16四體、真菌、病毒 4需要有實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察 Observe on Morphology and Structure of Bacteria【目的要求】1.熟悉實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)則,掌握無(wú)菌操作技術(shù)；2.掌握細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色的操作步驟和方法，結(jié)果判斷；3.掌握細(xì)菌及其特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、

3、鞭毛、芽孢）的形態(tài)特點(diǎn)。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1.實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)則(P3) ；1)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿白大褂，不要穿拖鞋入內(nèi)。2)不準(zhǔn)攜帶食品、飲料和餐具入室。3)上課前請(qǐng)不要?jiǎng)幼烂嫔系膶?shí)驗(yàn)器材，老師介紹完后才能開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)完成后統(tǒng)一下課。 4)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)生意外時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告老師，不要私自處理。5)實(shí)驗(yàn)完成后要求洗手離開。服從班干部安排，做好實(shí)驗(yàn)室 清潔，驗(yàn)收合格后簽字離開。【實(shí)驗(yàn)材料】 (1)菌種: 葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物。 (2)試劑:革蘭染色液。 (3)其他:生理鹽水、載玻片、酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、二甲苯等。2.細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察（Grams Stain)(每人做） (

4、P193) 菌苔【實(shí)驗(yàn)方法】1.細(xì)菌涂片的制作步驟：涂片 干燥 固定 注意點(diǎn)：1）無(wú)菌操作2）加生理鹽水（固體培養(yǎng)物）生理鹽水 生理鹽水 + +葡萄球菌 大腸桿菌載玻片涂片：在空氣中自然干燥或在火焰上方烘干（菌膜面向上，至少20cm)。干燥：固定：.將涂片以均勻的速度通過火焰，來(lái)回3次（菌膜面向上）。2.革蘭染色法（Gram stain）： No.1step-初染: No.2step- 媒染: No.3step-脫色: No.4step-復(fù)染 結(jié)晶紫和等量的碳酸氫鈉（3-5秒）碘液（3-5秒）丙酮酒精（3-5秒） 稀釋復(fù)紅（10-15秒） 倒掉染料，細(xì)水流沖洗，甩干倒掉染料，細(xì)水流沖洗，甩干倒

5、掉染料，細(xì)水流沖洗，甩干倒掉染料，細(xì)水流沖洗，甩干，烘干關(guān)鍵步驟：掌握脫色程度。（3）觀察標(biāo)本片自然干燥或在酒精燈火焰上烤干后,在涂菌處滴加1小滴香柏油,油鏡下觀察。【結(jié)果】觀察指標(biāo):形態(tài)、染色性、排列。1）形態(tài)單個(gè)細(xì)菌的形態(tài)：球菌，桿菌；2）染色性判斷革蘭陽(yáng)性菌染成藍(lán)色, 革蘭陰性菌染成紅色。3）排列散在排列，葡萄狀排列。Grams Stain,1000葡萄球菌:革蘭陽(yáng)性球菌,成堆或呈葡萄狀排列。脫色時(shí)間過長(zhǎng)大腸桿菌:革蘭陰性桿菌,不規(guī)則分散排列。Grams Stain,1000 電鏡照片3.細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察（示教鏡） (P204) 。注意點(diǎn)：觀察時(shí)只能動(dòng)顯微鏡的微調(diào),

6、不要?jiǎng)游恢?。要求：畫圖記錄。1）破傷風(fēng)桿菌的芽胞:芽胞染色1000鞭毛染色1000 2)變形桿菌的鞭毛:3)肺炎鏈球菌的莢膜:莢膜染色1000【實(shí)驗(yàn)注意點(diǎn)】1.生物安全、無(wú)菌操作,菌種管清理；2.顯微鏡(油鏡)的使用用后擦鏡頭；3.用過的載玻片放進(jìn)有消毒水的玻缸。4.做好清潔衛(wèi)生。【實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容】1.細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察（方法、結(jié)果畫圖、討論）；2. 細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）觀察（畫圖）?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告示范】實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1.實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)則（每人掌握）；2.細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察（Grams Stain)(每人做）；3.細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察（示教

7、鏡）?！緦?shí)驗(yàn)材料和方法】一、細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察1細(xì)菌涂片的制作菌種：葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物方法：1）細(xì)菌涂片的制作涂片 干燥 固定 涂片：如圖：生理鹽水 生理鹽水 + +葡萄球菌 大腸桿菌2）革蘭染色初染: 結(jié)晶紫和碳酸氫鈉各13滴,3s-5s，水沖凈,甩干。媒染: 碘液13滴,3s-5s秒鐘，水沖凈,甩干。脫色: 95%乙醇數(shù)滴,5s-10s, 水沖凈,甩干。復(fù)染: 稀釋石炭酸復(fù)紅液13滴,10s，水沖凈,甩干。3)結(jié)果見圖1-2:葡萄球菌:革蘭陽(yáng)性球菌,成堆或呈葡萄狀排列大腸桿菌:革蘭陰性桿菌,不規(guī)則分散排列Grams Stain,1000圖1圖24)討論 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過革蘭染色在油鏡下可清楚地觀察到標(biāo)本片上細(xì)菌的形態(tài)、染色性和排列狀態(tài)。革蘭染色可將細(xì)菌分為2大類，即染成藍(lán)色的革蘭陽(yáng)性菌和染成紅色的革蘭陰性菌。其原理是革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異。 結(jié)果不正確的影響因素分析：二、細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察結(jié)果見圖3-5。鞭毛染色10