1、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌整合子分布與ESBLs耐藥基因的研究【摘要】目的研究產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株整合子分布以及在ESBLs基因程度轉(zhuǎn)移中的作用。方法采用PR方法檢測產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的整合酶基因,分析整合子在產(chǎn)TE、TX和SHV型ESBLs菌株中的分布及經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的情況。結(jié)果產(chǎn)ESBLs菌株中blaTE、blaTX和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32.9%；產(chǎn)ESBLs菌同時具有1種的ESBLs基因,blaSHV+TX基因檢出率為12.9%、blaTX+TE為9.8%、blaSHV+TE為8.7%和blaSHV+TX+TE為

2、5.2%。結(jié)論產(chǎn)ESBLs菌株中blaTE、blaTX和blaSHV基因與整合子具明顯相關(guān)性；整合子攜帶著1個以上的多個耐藥基因盒,與宿主菌的多重耐藥性親密相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】耐藥基因超廣譜內(nèi)酰胺酶整合子【Abstrat】bjetiveTstudythedistributinflassintegrninextended-spetrubeta-lataases(ESBLs)-prduingEsherihialiandKlebsiellapneuniaeanditsntributininhrizntaltransferfESBLsgenes.ethdsThepreseneflassintegrnang

3、ESBLs-prduersandnn-ESBLs-prduersfEsherihialiandKlebsiellapneuniaeeredetetedbyplyerasehainreatin(PR).Therrelatinand-transferbeteenintegrnandgenesdingfrSHV,TXandTEerestudied.ResultsThepsitiveratefblaTE、blaTXandblaSHVas58.2%、74.7%、32.9%respetively;blaSHV+TX、blaTX+TE、blaSHV+TEandblaSHV+TX+TEas12.9%、9.8%

4、、8.7%、5.2%respetively.nlusinThepsitiveratefblaTE、blaTXandblaSHVasrelatedithlassintegrn;TheintegrnithantibitiresistanegeneassettentributestultidrugresistaneinESBLs-prduingstrains.【Keyrds】antibitiresistantgene;ESBLs;integrnESBLs是導(dǎo)致革蘭陰性菌對-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制。質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子對耐藥基因在細(xì)菌間的程度轉(zhuǎn)移起著重要作用。整合子可特異性地俘獲和表達(dá)外源基因

5、盒,并以質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子為載體在細(xì)菌間挪動,導(dǎo)致耐藥基因的快速和廣泛播散。整合子可攜帶對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺等耐藥基因盒。整合子大致可分為類,其中類在捕獲和表達(dá)耐藥基因中最常見。因此本文通過研究產(chǎn)ESBLs菌株中類整合子的分布和性質(zhì),明確菌株的播散趨勢,有效監(jiān)控細(xì)菌耐藥。由于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌是臨床最常見的產(chǎn)ESBLs菌,其中TX-、SHV和TE是最常見的ESBLs型別，本文對我院2022年肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的臨床別離株,檢測類整合子在產(chǎn)TE、TX和SHV型ESBLs菌株中的分布,明確類整合子在產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的流行和播散中的臨床意義。1材料與方法1.1菌株來

6、源281株肺炎克雷伯菌和201株大腸埃希菌均為我院臨床標(biāo)本中別離并按全國統(tǒng)一操作規(guī)程1。標(biāo)本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。1.2儀器試劑VITEK-2型全自動微生物分析儀、ID-GN鑒定卡、AST-GN09藥敏卡由法國Bi-erieux公司消費(fèi);VITEK比濁計(V1210)由日本消費(fèi)；PR擴(kuò)增儀為美國PERKINELER公司9600型基因擴(kuò)增儀；日本三洋DF型超低溫冰箱;德國Hettih公司22R型低溫超速離心機(jī);美國水套式恒溫培養(yǎng)箱。1.3菌種鑒定、藥敏所有實驗菌株別離純化后按VITEK-2的使用要求配制成菌懸液和稀釋液,分別填充到ID-GN和AST-GN09卡中,用VITEK-2儀

7、器自動完成細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗。1.4質(zhì)控菌株由衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌(AT25922)、銅綠假單胞菌(AT27853),藥敏質(zhì)控結(jié)果符合NLS藥敏質(zhì)控要求。15超廣譜內(nèi)酰胺酶ESBLs檢測按照NLS2000年版推薦的紙片擴(kuò)散表型確證法進(jìn)展檢測。用肺炎克雷伯菌AT700603為陽性對照，大腸埃希菌AT2592為陰性對照。1.6耐藥基因的檢測采用堿裂解法和蛋白酶K法提取被測細(xì)菌的質(zhì)粒和染色體基因,提取方法根據(jù)不同引物設(shè)立不同PR條件；以AT700603肺炎克雷伯菌和TE-26型大腸埃希菌分別作SHV型和TE型陽性對照。17質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移將產(chǎn)ESBLs菌株和大腸埃希菌培養(yǎng)到對數(shù)生

8、長期,按6：1v/v接種,37培養(yǎng),用含頭孢噻肟(1g/l)的培養(yǎng)基挑選接合菌,制備模板用于PR擴(kuò)增。1.8PR耐藥菌基因2根據(jù)GenBank公布的類整合子整合酶基因和blaSHV、blaTX和blaTE基因序列，采用Prier軟件設(shè)計引物(表1)。反響體系均為25l,其中緩沖液2.5l,10l/L4dNTP0.5l,50l/上下游引物各1l,DNA多聚酶0.25l,DNA模板1l,超純水18.75l。根據(jù)不同引物設(shè)立不同PR反響條件。以AT700603肺炎克雷伯菌作SHV型陽性對照，以TE-26型大腸埃希菌作TE型陽性對照,產(chǎn)物經(jīng)電泳,在紫外線下觀察結(jié)果,并在凝膠上成像。1.9DNA序列分析

9、3PR擴(kuò)增的基因片段經(jīng)電泳后,切下相應(yīng)條帶純化,進(jìn)展DNA測序,結(jié)果在GenBank序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)展同源性分析(BLASTN)。110統(tǒng)計學(xué)處理2細(xì)菌耐藥性分析用HNET5軟件進(jìn)展分析，耐藥率差異有顯著性，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析,兩組耐藥率比擬應(yīng)用2檢。表1用于檢測耐藥基因的引物2結(jié)果與分析21ESBLs檢出結(jié)果及耐藥率281株肺炎克雷伯菌和201株大腸埃希菌共檢出ESBLs194株，占40.%,非產(chǎn)ESBLs細(xì)菌為288株占59.7%。產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對抗生素的平均耐藥率為74.1%,明顯較非產(chǎn)ESBLs株平均耐藥率47.9%高(P0.05)。產(chǎn)ESBLs的大腸埃

10、希菌和肺炎克雷伯菌除頭孢替坦外，對其他頭孢類抗生素的耐藥率均在90%以上；對內(nèi)酰胺和碳青霉烯類如氨芐西林、氨曲南和哌拉西林的耐藥率為100%，僅對美洛培南和亞胺培南二種抗生素未產(chǎn)生耐藥；產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對多種抗生素耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株(P0.05)(表2)。表2產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs菌對抗生素的耐藥率22產(chǎn)ESBLs菌株的PR檢測對13株產(chǎn)ESBLs菌株(其中8株大腸埃希菌和5株肺炎克雷伯菌)的PR產(chǎn)物測序，其中blaTE陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物為TE-1基因,blaTX陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物為TX-3基因,而blaSHV陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物那么分別為SHV-1、SHV-5、S

11、HV-11和SHV-12。blaTE、blaTX和blaSHV基因的PR瓊脂凝膠電泳如圖13。圖1TE基因PR擴(kuò)增電泳圖圖2SHV基因PR擴(kuò)增電泳圖(1：DNA分子量標(biāo)志,2000bp梯帶；2:陰性對照；35:臨床菌株。)圖3TX基因PR擴(kuò)增電泳圖2.3blaTE、blaTX和blaSHV的基因檢測結(jié)果產(chǎn)ESBLs菌株的blaTE、blaTX和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32.9%，產(chǎn)ESBLs菌同時具有1種的ESBLs基因如blaSHV+TX、blaTX+TE、blaSHV+TE和blaSHV+TX+TE基因檢出率分別為12.9%、9.8%、8.7%和5.2%。其中9

12、3株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中,blaTE基因檢出率為81.7%(76/93),blaTX基因檢出率為94.6%(88/93),blaSHV基因檢出率14.0%(13/93)，blaSHV+TX基因檢出率12.9%(12/93)，blaTX+TE基因檢出率8.6%(8/93)，blaSHV+TE基因檢出率9.7%(9/93),blaSHV+blaTX+blaTE基因檢出率4.3%(4/93)。101株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中,blaTE基因檢出率為36.7%(37/101),blaTX基因檢出率為56.4%(57/101),blaSHV基因檢出率為50.5%(51/101),blaSHV+TX

13、基因檢出率12.9%(13/101)，blaTX+TE基因檢出率10.9%(11/101)，blaSHV+TE基因檢出率7.9%(8/101),blaSHV+blaTX+blaTE基因檢出率5.9%(6/101)(表3)。24產(chǎn)ESBLs菌株陽性和陰性整合子對抗菌藥物的耐藥率兩組對頭孢類抗生素如頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率均90%，經(jīng)2檢驗P0.05差異無顯著性，而產(chǎn)ESBLs菌株陽性對頭孢噻肟和頭孢唑啉的耐藥率也均90%，但與整合子陰性的產(chǎn)ESBLs菌株比擬P0.05，差異有顯著性。產(chǎn)ESBLs菌株陽性整合子對其他抗生素如氨芐西林和哌拉西林的耐藥率均高于整合子陰性產(chǎn)ESBLs菌株,經(jīng)2檢驗,差

14、異有顯著性(P0.05)。兩組對亞胺培南和美洛培南的耐藥率均很低表4。表33種基因型PR產(chǎn)物在產(chǎn)ESBLs菌株中的分布表4產(chǎn)ESBLs菌株陽性和陰性整合子對抗菌藥物的耐藥率3討論大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，常寄殖于人體上呼吸道和腸道，是重要的條件致病菌和院內(nèi)感染常見的病原體之一4。ESBLs主要在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)。本文ESBLs從大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的檢出率為40.3%。產(chǎn)ESBLs菌對常用抗生素的平均耐藥率高達(dá)74.0%,對氨芐西林、環(huán)丙沙星、一二三代頭孢菌素均具有很高的耐藥率，產(chǎn)生了明顯的多重耐藥5。由于ESBLs是質(zhì)粒介導(dǎo)，可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合轉(zhuǎn)移等方式傳

15、遞而造成耐藥菌流行。質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子對耐藥基因在細(xì)菌間的程度轉(zhuǎn)移起著重要作用5，6。本文用PR檢測產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中類整合子的分布,結(jié)果顯示blaTE陽性的壙增產(chǎn)物為TE-1基因,blaTX陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物為TX-3基因,而blaSHV陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物那么分別為SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12基因。blaTE、blaTX和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32.9%，說明產(chǎn)ESBLs菌株中blaTE、blaTX和blaSHV基因與整合子具明顯相關(guān)性，但三者經(jīng)質(zhì)粒與整合子共同轉(zhuǎn)移的頻率不同。其中blaTX的轉(zhuǎn)移率最高,到達(dá)74.7%,其次為blaTE58.2%，blaSHV的轉(zhuǎn)移率最低。提示本文中產(chǎn)ESBLs臨床別離株中的blaTX與整合子嚴(yán)密相關(guān)。推測blaTX可能位于整合子中或者與整合子位于同一個接合性質(zhì)粒的遺傳