1、雙向電泳的全套實(shí)驗(yàn)步驟及其注意事項(xiàng)本手冊(cè)向您提供雙向電泳實(shí)驗(yàn)過(guò)程中從樣品制備、IEF電泳、膠條平衡、SDS、凝膠染色脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)的切取、膠內(nèi)胰酶消化以及質(zhì)譜樣品的制備等全部實(shí)驗(yàn)步驟，為您的實(shí)驗(yàn)提供全流程的幫助。細(xì)胞樣品的一般處理步驟吸出培養(yǎng)液，用胰酶消化或細(xì)胞刮子收獲細(xì)胞。加入PBS溶液，1500g離心10分鐘，棄上清。重復(fù)3次。加入5倍體積裂解液，或按1X106細(xì)胞懸于60100u1裂解液中混勻。液氮中反復(fù)凍融3次。力口50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4C放置15分鐘。15,000轉(zhuǎn)，4C離心15分鐘。7收集上清，分裝分裝后凍存于一70Co組織樣品的一般處理步驟

2、碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。將適量粉末狀組織轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入適量裂解液，進(jìn)行勻漿力口50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4C放置15分鐘。15,000轉(zhuǎn)，4C離心20分鐘。5收集上清，分裝后凍存于一70Co雙向電泳中溶液配制水化上樣緩沖液（I）：尿素8M4.805gDTT65mM0.098g（現(xiàn)加）Bio-Lyte0.2%（w/v）50pl（40%）（現(xiàn)加）溴酚藍(lán)0.001%10皿（1%溴酚藍(lán)）MilliQ水定容至10ml；分裝成10小管，每小管1ml,-20C冰箱保存尿素7M4.2g硫脲2M1.52gCHAPS4%0.4gDTT65mM0.098g（現(xiàn)加）Bio-Lyte

3、0.2%（w/v）50pl（40%）（現(xiàn)加）溴酚藍(lán)0.001%10pl（1%溴酚藍(lán)）MilliQ水定容至10ml；分裝成10小管，每小管1ml,-20C冰箱保存尿素5M3.0g硫脲2M1.52gCHAPS2%0.2gSB3-102%0.2gDTT65mM0.098g（現(xiàn)加）Bio-Lyte0.2%（w/v）50pl（40%）（現(xiàn)加）溴酚藍(lán)0.001%10pl（1%溴酚藍(lán)）MilliQ水定容至10ml；分裝成10小管，每小管1ml,-20C冰箱保存水化上樣緩沖液（II）：水化上樣緩沖液（III）：CHAPS4%0.4g膠條平衡緩沖液母液：尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375Mp

4、H8.825ml(1.5MpH8.8Tris-HCl)甘油20%20ml15mol/LTris堿pH88：10%SDS：SDSMilliQ水10%ApApMilliQ水Tris堿90.75gMilliQ水400ml10g用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8,加MilliQ水定容至500ml4C冰箱保存。100ml混勻后，室溫保存。0.1g1ml（用時(shí)加水溶解）溶解后，4C冰箱保存。MilliQ水定容至100ml；分裝成10管，每管10ml,-20C冰箱保存。膠條平衡緩沖液I:膠條平衡緩沖液母液10mlDTT0.2g充分混勻，用時(shí)現(xiàn)配。膠條平衡緩沖液II:膠條平衡緩沖液母液10ml碘乙酰胺0.25

5、g充分混勻，用時(shí)現(xiàn)配。低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液：低熔點(diǎn)瓊脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml(10%SDS)溴酚藍(lán)0.001%100皿（1%溴酚藍(lán)）MilliQ水定容至100ml；加熱溶解至澄清，室溫保存。30%聚丙烯酰胺貯液:丙烯酰胺150g甲叉雙丙烯酰胺4gMilliQ水500ml濾紙過(guò)濾后，棕色瓶4C冰箱保存。10X電泳緩沖液(1X=25mMTris,192mMglycine,0.1%SDS,pH8.3)Tris堿30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混勻后,室溫保存。第一向等電聚焦操作步驟（用自制的電泳上樣緩沖液，17cm

6、的膠條，pH4-7）從-20C冰箱中取出保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）小管（1ml/管），置室溫溶解。在小管中加入0.01gDTT,Bio-Lyte4-6、5-7各2.5pl，充分混勻。從小管中取出400山水化上樣緩沖液，加入100山樣品，充分混勻。從-20C冰箱取出保存的IPG預(yù)制膠條（7cmpH3-10）,室溫放置10分鐘。沿著聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中槽的邊緣至左而右線(xiàn)性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的

7、保護(hù)層。分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤(pán)的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。10聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向SDS電泳，否則將膠條置于樣品水化盤(pán)中，

8、-70C冰箱保存。等電聚焦程序設(shè)置7cm膠條：水化50V12-16小時(shí)（17C）主動(dòng)水化S1250V線(xiàn)性30分鐘除鹽S2500V快速30分鐘除鹽S34000V線(xiàn)性3小時(shí)升壓S44000V快速20,000伏小時(shí)聚焦S5500V快速任意時(shí)間保持選擇所放置的膠條數(shù)；設(shè)置每根膠條的極限電流。（30-50pA/根）；設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度。（17C）11cm膠條：水化50V12-16小時(shí)（17C）主動(dòng)水化S1250V線(xiàn)性30分鐘除鹽S21000V快速30分鐘除鹽S38000V線(xiàn)性4小時(shí)升壓S48000V快速40,000伏小時(shí)聚焦S5500V快速任意時(shí)間保持選擇所放置的膠條數(shù)；設(shè)置每根膠條的極限電流（50p

9、A/根）；設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度（17C）17cm膠條：水化50V12-16小時(shí)（17C）主動(dòng)水化S1250V線(xiàn)性30分鐘除鹽S21000V快速1小時(shí)除鹽S310000V線(xiàn)性5小時(shí)升壓S410000V快速60,000伏小時(shí)聚焦S5500V快速任意時(shí)間保持選擇所放置的膠條數(shù)；設(shè)置每根膠條的極限電流（50-70pA/根）；設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度（17C）等電聚焦注意事項(xiàng)配好的尿素儲(chǔ)液必須馬上使用，或用mixed-bed離子交換樹(shù)脂，清除長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)尿素溶液中形成的氰酸鹽，預(yù)防蛋白質(zhì)的甲?；?。將水化上樣緩沖液分裝后再儲(chǔ)存于-20C。用時(shí)，只要解凍需要量，其余繼續(xù)儲(chǔ)存。水化上樣緩沖液一旦溶解不能再冷凍。將

10、水化上樣緩沖液加入蛋白樣品中，終溶液中urea的濃度需26.5M。等電聚焦溶脹緩沖液和樣品溶液中都要加入兩性電解質(zhì)，它能夠幫助蛋白質(zhì)溶解。兩性電解質(zhì)的選擇取決于IPG膠條的pH范圍。下表可提供參考。IPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(Stock)SampleSolutionVolumeRangeConc.(w/v)Per5mlper50ml3-103-1040%25ul250ul4-74-640%12.5ul125ul5-740%12.5ul125ul3-63-520%25ul250ul4-640%12.5ul125ul5-85-840%25ul250ul7-107-940

11、%12.5ul125ul8-1020%25ul250ul下表顯示的是通常推薦使用的雙向電泳第一向蛋白上樣量。因?yàn)闃悠泛蜆悠分g存在差異，所以這種上樣量?jī)H提供參考。對(duì)于窄pH范圍的IPG膠條，需要比寬pH范圍的IPG膠條上更多的樣品，這是因?yàn)閜I值不在此范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)在等電聚焦的過(guò)程中會(huì)走出膠條。單pH范圍IPG膠條的上樣量是通常的4-5倍還多，這樣就可以很好的檢測(cè)低豐度的蛋白質(zhì)。IPG膠條的長(zhǎng)度分析型的上樣量（銀或SYPRORuby染色）制備型的上樣量（考馬斯亮藍(lán)染色）7cm10-100ug蛋白200-500ug蛋白11cm50-200ug蛋白250-1,000ug蛋白17cm100-300u

12、g蛋白1-3mg蛋白樣品溶液的上樣體積見(jiàn)下表。這樣就可以使膠條溶脹至它們?cè)瓉?lái)的厚度（0.5mm）。膠條最少需要經(jīng)過(guò)11小時(shí)的溶脹。即使看上去所有的緩沖液都已經(jīng)被吸收，也一定要確保膠條在槽中溶脹充分的時(shí)間。只有在IPG凝膠的孔徑已經(jīng)溶脹充分后，才可以吸收大分子量蛋白質(zhì)，否則大分子量蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入膠條。ReadyStripTMPG膠條的長(zhǎng)度上樣體積7cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul如果在等電聚焦過(guò)程中，聚焦盤(pán)中還有很多的溶液沒(méi)有被吸收，留在膠條的外面，這樣就會(huì)在膠條的表面形成并聯(lián)的電流通路，而在這層溶液中蛋白質(zhì)不會(huì)被聚焦。這就會(huì)導(dǎo)致蛋白的丟失或

13、是圖像拖尾。為了減少形成并聯(lián)電流通路的可能性，可以先將膠條在溶脹盒中進(jìn)行溶脹，然后再將溶脹好的膠條轉(zhuǎn)移到聚焦盤(pán)中。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，要用濕潤(rùn)的濾紙仔細(xì)地從膠條上吸干多余的液體。帶上手套用鑷子去除IPG膠條上的保護(hù)層。將IPG膠條仔細(xì)的置于溶脹緩沖液上，膠面朝下，確保整個(gè)膠面都能被浸濕。在樣品溶液中加入痕量的溴酚藍(lán)對(duì)觀(guān)察溶脹過(guò)程很有幫助。在覆蓋礦物油之前，可以讓膠條先吸收1小時(shí)的液體。IPG膠條上一定要覆蓋礦物油，否則緩沖液會(huì)蒸發(fā)，使得溶液濃縮，導(dǎo)致尿素沉淀。作為防止緩沖液蒸發(fā)的預(yù)防措施，礦物油必須緩緩地加在每個(gè)槽內(nèi)，確保完全的覆蓋住每一根膠條。下面的表格給出了建議使用的IPG膠條運(yùn)行的總volt-

14、hours。這僅提供參考，不同的樣品需要的volt-hours不同。當(dāng)聚焦過(guò)程無(wú)法達(dá)到最高電壓時(shí)，只要最后能達(dá)到總的volt-hours，且7cm膠條電壓不低于3000伏，11cm膠條電壓不低于5000伏，17cm膠條電壓不低于7000伏，也能對(duì)樣品進(jìn)行充分的聚焦。ReadyStripIPG膠條的長(zhǎng)度最高電壓建議的Volt-Hours7cm&000V&000-10,000V-hr11cm&000V20,000-40,000V-hr17cm10,000V30,000-60,000V-hr為使樣品進(jìn)入膠的效率增加，采用50V低電壓溶脹；繼續(xù)以低電壓梯度（200V,500V,1000V各一個(gè)小時(shí)）進(jìn)

15、行電泳，最后達(dá)到10000V進(jìn)行聚焦。處理預(yù)制IPG膠條時(shí)，一定要始終帶著手套。注意預(yù)防角蛋白污染。水化上樣緩沖液的成分由不同的樣品決定。每根膠條蛋白質(zhì)的總上樣量由特定的樣品，膠條的pH范圍，及最終的檢測(cè)方式?jīng)Q定。下表是進(jìn)行銀氨染色時(shí)的蛋白質(zhì)上樣參考。ReadyStrip7cm11cm17cm3-105-100ug20-200ug50-300ug4-710-150ug40-200ug80-300ug3-610-150ug40-200ug80-300ug5-810-150ug40-200ug80-300ug7-1020-200ug50-300ug100-300ug所有含尿素的溶液加熱溫度不超過(guò)3

16、0C，否則會(huì)發(fā)生蛋白氨甲?；?，使蛋白質(zhì)pI值偏移。主動(dòng)水化過(guò)程，會(huì)幫助大分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)入膠條，但會(huì)丟失部分小分子量蛋白。17.當(dāng)樣品中含鹽量較高時(shí)，建議選用慢速升壓。當(dāng)樣品中含鹽量一般時(shí)，選用線(xiàn)性升壓。當(dāng)樣品中含鹽量很少時(shí)，可以選用快速升壓，這樣可以節(jié)省聚焦時(shí)間。雖然儀器中每根膠條的極限電流可以設(shè)為99yA/根。但一般7cm膠條的極限電流不超過(guò)30yA/根，17cm膠條的極限電流不超過(guò)50yA/根，最好也在30yA/根以下。可以在聚焦盤(pán)的兩端電極處搭上鹽橋，這可以幫助除鹽。但需注意的是，鹽橋必須是濕潤(rùn)的但水不能太多，必要時(shí)需用濾紙吸去多余的水份。保持鹽橋與電極的緊密接觸。程序設(shè)置中的除鹽步驟

17、，可根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置，如果樣品中含鹽量較高可設(shè)置多步除鹽，并加長(zhǎng)除鹽時(shí)間。但這種方法只能除去很少量的鹽離子，所以最好是在上樣前，對(duì)樣品進(jìn)行除鹽處理。第二向SDS電泳配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40m1,將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。從-20C冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。配制膠條平衡緩沖液I。在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好

18、的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤(pán)中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤(pán)放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。配制膠條平衡緩沖液II。第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤(pán)中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。用濾紙吸去SDS聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上

19、，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。將10X電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成IX電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。12第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤(pán)中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。將IPG膠條從樣品水化盤(pán)中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1X電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙

20、烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線(xiàn)后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm）,待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。進(jìn)行染色。膠條平衡中的注意事項(xiàng)1.不同長(zhǎng)度的膠條，選用

21、不同體積的膠條平衡緩沖液?？蓞⒖枷卤怼Ｄz條的長(zhǎng)度7cm11cm17cm膠條平衡緩沖液I2.5ml4ml6ml膠條平衡緩沖液II2.5ml4ml6ml從冰箱中取出得膠條一定要先解凍。膠條平衡緩沖液I和膠條平衡緩沖液II都要現(xiàn)配，因?yàn)镈TT和碘乙酰胺在室溫的半衰期很短。平衡過(guò)程導(dǎo)致蛋白丟失約5%-25%，還會(huì)使分辨率降低，平衡30分鐘時(shí)，蛋白帶變寬40%，所以平衡時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)。如果不經(jīng)平衡，把等電聚焦凝膠直接放在第二向凝膠上會(huì)導(dǎo)致高分子量蛋白的紋理現(xiàn)象，并且等電聚焦凝膠會(huì)粘在SDS膠上?？s短平衡時(shí)間可以減少擴(kuò)散，但同時(shí)會(huì)減少向第二向的轉(zhuǎn)移。所以平衡時(shí)間要充分長(zhǎng)（至少2X10分鐘），但也不要超過(guò)（2

22、X15分鐘）。5平衡緩沖液包括Tris-HCl（pH8.8）,SDS（2%），高濃度尿素（6M）和甘油（20%）提高蛋白的溶解度并減少電內(nèi)滲。第一步加入DTT（1%）是為了使蛋白去折疊；第二步加入碘乙酰胺是為了去除多余的DTT（銀染過(guò)程中，DTT會(huì)導(dǎo)致電脫尾）。6.對(duì)于非常疏水或含有二硫鍵的蛋白，TBP（tributylphosphine）比DTT和碘乙酰胺更有效。膠條轉(zhuǎn)移過(guò)程的注意事項(xiàng)1在瓊脂糖中加入少量的溴酚藍(lán)，可以觀(guān)察到電泳的進(jìn)程。2瓊脂糖的溫度不能太高，熱的瓊脂糖會(huì)加速平衡緩沖液中尿素的分解。3當(dāng)用瓊脂糖覆蓋膠條時(shí)，常會(huì)在膠條的下面或背面形成氣泡。這些氣泡會(huì)干擾蛋白質(zhì)的遷移，所以必須去

23、除。通常在剛加入瓊脂糖后，趕快用鑷子、壓舌板或平頭針頭輕壓膠條塑膠支撐膜的上方，驅(qū)趕氣泡。4如果選用的是普通瓊脂糖，先將膠條推進(jìn)玻璃板中，使之與第二向凝膠緊密接觸，然后再加入瓊脂糖封膠液。這是因?yàn)槠胀ō傊侨埸c(diǎn)較高，凝固較快。SDS凝膠電泳時(shí)的注意事項(xiàng)1玻璃板一定要清洗干凈，否則在染色時(shí)會(huì)有不必要的凝膠背景。過(guò)硫酸銨（Ap）要新鮮配制。40%的過(guò)硫酸銨儲(chǔ)存于冰箱中只能使用2-3天，低濃度的過(guò)硫酸銨溶液只能當(dāng)天使用。蛋白質(zhì)從一向（IPG膠條）到二向（SDS凝膠）轉(zhuǎn)移時(shí)，為避免點(diǎn)脫尾和損失高分子量蛋白，應(yīng)緩慢進(jìn)行（場(chǎng)強(qiáng)小于10V/cm）。用MiniProtein3電泳槽時(shí)，以電流為標(biāo)準(zhǔn)，開(kāi)始進(jìn)樣的

24、低電流為5mA/gel，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線(xiàn)后，再加大電流到10-15mA/gel；以電壓為標(biāo)準(zhǔn)，開(kāi)始進(jìn)樣的低電壓為50-75V/gel，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線(xiàn)后，再加大電壓到150-200V/gel。用ProteinII電泳槽時(shí)，以電流為標(biāo)準(zhǔn)，開(kāi)始進(jìn)樣的低電流為10mA/gel,待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線(xiàn)后，再加大電流到20-30mA/gel；以電壓為標(biāo)準(zhǔn)，開(kāi)始進(jìn)樣的低電壓為75T00V/gel，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線(xiàn)后，再加大電壓到300-400mA/gel。聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的配置表1配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液不同體積（m

25、l）凝膠液中各成分所需體積（ml）溶液成分5101520253040506%水2.65.37.910.613.215.921.226.530%丙烯酰胺溶液1234568101.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048%水2.34.66.99.311.513.918.523.230%丙烯酰胺溶液1.32.745.36.7810.713.31

26、.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310%水1.945.97.99.911.915.919.830%丙烯酰胺溶液1.73.356.78.31013.316.71.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸氨0.050.1

27、0.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0212%水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2468101216201.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0215%水1.12.33.44.65.76.99.211.530%丙烯酰

28、胺溶液2.557.51012.51520251.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02表2配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5%積層膠所用溶液不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）溶液成分123456810水0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.8311.31.71.5mol/LTris(pH8.8)0.130.250.380.50.630.7501.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%過(guò)硫酸氨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01蛋白質(zhì)的銀染靈敏度：2ng/band試劑：1、硝酸銀（批次不同對(duì)靈敏度有影響