1、流式細胞術的原理(yunl)及其應用 馬洪星第一頁，共八十一頁。第二頁，共八十一頁。FLOW CYTOMETRY 流式細胞術FLOW CYTOMETOR 流式細胞儀第三頁，共八十一頁。Flow Cytometry Measuring properties of cells in flowFlow SortingSorting (separating) cells based on properties measured in flowAlso called Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)第四頁，共八十一頁。分為三大類： 第一類臺式機 光路調

2、節(jié)系統(tǒng)(xtng)固定，自動化程度高，操作簡便，易學易掌握,適合 用于臨床 第二類大型機 科研型，分辨率高，可分選用于培養(yǎng)，可選配多種激光器，更靈活 第三類新型流式細胞儀 裝配有24根激光管，同時檢測15個參數(shù)，高速分選達50000個/s第五頁，共八十一頁。第六頁，共八十一頁。第七頁，共八十一頁。第八頁，共八十一頁。第九頁，共八十一頁。流式細胞儀的主要(zhyo)組成部分：光路系統(tǒng)(xtng)鞘液系統(tǒng)(xtng)信號轉換及放大系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第十頁，共八十一頁。 流式細胞術是20世紀70年代發(fā)展起來的一種技術，有人將流式細胞儀比喻成高級的熒光顯微鏡。 目前，該技術以廣泛用于生物及醫(yī)學基礎研究與

3、臨床檢測，在分子生物學、免疫學、遺傳學、血液學、腫瘤學等領域(ln y)內發(fā)揮著重要作用。第十一頁，共八十一頁。流式細胞儀熒光顯微鏡控制電腦人腦光源激光紫外光標本制備成的單細胞（或顆粒）懸液放于固定的標本臺上效率高 幾百幾萬個細胞/秒低 幾十個細胞/分結果精確、客觀有主觀因素功能可同時測多個參數(shù)、能進行分選一般只測一個參數(shù)、不能分選第十二頁，共八十一頁。鞘液系統(tǒng)(xtng)流動(lidng)室第十三頁，共八十一頁。第十四頁，共八十一頁。光路系統(tǒng)(xtng)檢測(jin c)區(qū)第十五頁，共八十一頁。第十六頁，共八十一頁。第十七頁，共八十一頁。第十八頁，共八十一頁。第十九頁，共八十一頁。第二十頁，

4、共八十一頁。光學(gungxu)原理laser第二十一頁，共八十一頁。第二十二頁，共八十一頁。第二十三頁，共八十一頁。第二十四頁，共八十一頁?？贵w(kngt)標記的方法第二十五頁，共八十一頁?？贵w(kngt)的選擇首選直接標記抗體熒光分子 PE最強，適用(shyng)于弱表達抗原 FITC最便宜，適用于強表達抗原間接標記 適用范圍廣, biotin-avidin不適合 弱抗原的檢測第二十六頁，共八十一頁。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第二十七頁，共八十一頁。流式細胞分析(fnx)的信息Forward scatter(FSC)Side scatter(SSC)FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPPL4-

5、APC第二十八頁，共八十一頁。流式細胞的基本信息(xnx): “形態(tài)”第二十九頁，共八十一頁。流式細胞的主要(zhyo)信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的標記方法是熒光素分子標記的抗體與細胞抗原(kngyun)結合第三十頁，共八十一頁。Gating常用(chn yn)術語第三十一頁，共八十一頁。流式常見(chn jin)圖形 (Histogram Plot)直方圖適用(shyng)于：單參數(shù)分析第三十二頁，共八十一頁。流式常見(chn jin)圖形 (Dot Plot)散點圖適用(shyng)于：多參數(shù)分析第三十三頁，共八十一頁。流式應用(yngyng)常見范圍細胞

6、大小細胞的顆粒度細胞表面分子(fnz)：CD 系列細胞漿內分子：胞內細胞因子細胞核內分子：P53細胞功能檢測：細胞周期、凋亡其他（膜電位、鈣離子濃度、核酸等）第三十四頁，共八十一頁。實驗(shyn)對照的設計空白對照：ALL陰性對照：常用同型抗體對照 單色分析：設同型抗體對照 多色分析：同型對照，單陽性(yngxng)對照 （用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時第三十五頁，共八十一頁。實驗標本(biobn)的處理單細胞懸液的制備： 物理法（剪碎法、 網搓法、研磨粉） 化學法（酶消化）抗體或標記分子的染色：抗原(kngyun)抗體反應非特異結合的去除：洗滌和封閉 封閉血清和同型抗體第三十六頁，共八

7、十一頁?？捎昧魇郊毎麅x分析(fnx)的標本 外周血、骨髓( su)、癌組織、癌旁組織、石蠟切片、各種體液（尿、腦脊液、胸腹水等） 必需(bx)制備成單細胞懸液單細胞生物、特殊處理的植物細胞、某些非細胞粒子、可溶性分子第三十七頁，共八十一頁。 待測標本 處理成單event懸液 熒光素標記的單抗染色(rns) 鞘液 經處理的細胞單個通過激光聚焦區(qū) 檢測散射光、熒光 信號轉化、放大 計算機數(shù)據(jù)處理 分選第三十八頁，共八十一頁。SORTING（細胞(xbo)分選）分選速度(sd)分選純度分選收獲率第三十九頁，共八十一頁。第四十頁，共八十一頁。流式細胞術的應用(yngyng) 細胞死亡分兩種：凋亡和壞死

8、 細胞凋亡是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用；它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細胞發(fā)生凋亡時，就像樹葉(sh y)或花的自然凋落一樣，借用希臘“Apoptosis”來表示，意思是像樹葉或花的自然凋落，可譯為細胞凋亡。（一）凋亡(dio wn)的檢測第四十一頁，共八十一頁。細胞凋亡與壞死的區(qū)別雖然凋亡與壞死的最終結果極為相似(xin s)，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。壞死（necrosis）：壞死是細胞受

9、到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA 降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。凋亡是細胞對環(huán)境的生理性、病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產生的應答有序變化的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。第四十二頁，共八十一頁。細胞(xbo)凋亡的生物學意義 胚胎形成、肌體(jt)正常發(fā)育、衰老和損傷細胞的清除以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉歸等都與細胞凋亡有關。生物醫(yī)學的研究(ynji)熱點第四十三頁，共八十一頁。凋亡(dio wn)檢測每一步都有檢測試劑盒每一步(y b)都有檢測試劑盒第四十四頁，共八十一頁。1、半胱

10、氨酸蛋白酶3檢測法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）3、Apo2.7檢測法（早期）4、TUNEL 法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細胞凋亡相關基因(jyn)的流式細胞術檢測流式細胞(xbo)術檢測細胞(xbo)凋亡第四十五頁，共八十一頁。 亞二倍體峰（凋亡峰） - PI staining不能區(qū)分(qfn)凋亡與死亡細胞第四十六頁，共八十一頁。Annexin V Assay建議(jiny)用于懸浮細胞第四十七頁，共八十一頁。Annexin V Assay能夠(nnggu)區(qū)分死亡與凋亡第四十八頁，共八十一頁。第四十九頁，共八十一頁。細胞周期G1MG2SQui

11、escent cellsG0第五十頁，共八十一頁。（二）定量流式細胞術 （quantitative flow cytomety) 通過檢測標準微球的熒光強度獲得標準曲線，通過標準曲線求得待測細胞的某種生物分子的精確數(shù)值，從而反映(fnyng)在某種生理病理條件下出現(xiàn)的微細變化，對臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義。第五十一頁，共八十一頁。微球流式芯片(xn pin)技術CBA(Cytometric Bead Array)采用夾心法分析策略,以微珠來捕獲(bhu)可溶性分子。第五十二頁，共八十一頁。（三）流式細胞術的臨床(ln chun)應用白血病免疫分型HLA-B27: 強直性脊柱炎淋巴

12、細胞亞群造血干細胞計數(shù)：造血干細胞移植網織紅細胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化(huhu)試驗第五十三頁，共八十一頁。流式細胞術與造血(zo xu)干細胞移植第五十四頁，共八十一頁。流式細胞術與白血病免疫(miny)分型第五十五頁，共八十一頁。流式細胞的免疫(miny)分型：是白血病分型的重要指標，而白血病分類(fn li)是選擇化療方案和判斷預后的重要依據(jù)。 FAB標準(MICM)，形態(tài)學、免疫表型染色體、分子生物學結合,適合于白血病的分型診斷，但不適合用于確診是不是白血病。Minimal residual diseases (MRD)第五十六頁，共八十一頁。微小殘留病變的檢出（

13、MRD）： MRD是白血病復發(fā)的主要(zhyo)根源，F(xiàn)CM的高特異性和敏感性可以在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，早期探測MRD，以免復發(fā)。 第五十七頁，共八十一頁。 有證據(jù)表明外周血淋巴細胞HLA-B27的表達及其表達程度與強直性脊髓炎的發(fā)生有很大相關性，利用流式細胞術進行HLA-B27檢測，可同時排除(pich)交叉反應，是目前檢測HLA-B27的最好方法。流式細胞術與強直性脊柱炎第五十八頁，共八十一頁。第五十九頁，共八十一頁。淋巴細胞亞群分析 機體免疫狀態(tài)(zhungti)是衡量機體是否罹患疾病的重要指標，目前多采用流式細胞術來檢測機體的免疫狀態(tài)(zhungti)，其中最重要的指標是

14、檢測T,B,NK淋巴細胞的水平。第六十頁，共八十一頁。常用細胞表型及意義（cluster of differentiation,CD)CD3 總T細胞CD4 T輔助/誘導(yudo)細胞亞群CD8 T抑制/細胞毒細胞亞群CD19 B細胞抗原CD16+56 NK細胞CD33 髓細胞前體CD34 多能干細胞第六十一頁，共八十一頁。 由于T淋巴細胞在人體的免系統(tǒng)中承擔著重要功能，因此當感染發(fā)生(fshng)時，T淋巴細胞各亞群的變化往往能很敏感地反應感染的狀態(tài)和程度。例如：CD4分子有HIV識別部位，因CD4細胞是HIV病毒的受體，AIDS患者CD4+T細胞明顯減少，該指標是診斷AIDS的重要指標。

15、當病毒感染發(fā)生時（如乙型肝炎、EB病毒和巨細胞病毒包涵體病毒），CD8+T細胞增多，對CD8T細胞測定有助于對感染的診斷、治療效果的動態(tài)觀察。 第六十二頁，共八十一頁。 利用流式細胞儀可對器官移植和骨髓移植后的患者進行監(jiān)控。當患者CD3+、CD25+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+ T持續(xù)下降(xijing)，表明有感染發(fā)生，當其比值小于0.2時必需停用免疫抑制劑。 流式細胞術與移植(yzh)第六十三頁，共八十一頁。其它免疫性疾病分析 SLE患者的淋巴細胞變化可以反應該病的活動(hu dng)情況和器官侵犯程度，活動(hu dng)或非活動(hu dng)性伴有多系統(tǒng)疾病，但無腎

16、臟損害的患者可出現(xiàn)CD4+ CD8+T比值升高， 伴有嚴重腎臟損害的SLE患者可出現(xiàn)低CD4+、高CD8+的現(xiàn)象。 第六十四頁，共八十一頁。流式細胞術與PNH 利用流式細胞術檢測陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH），根據(jù)血細胞的細胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所連接的蛋白，如DAF（CD55）與MIRI（CD59），來確診此病，比傳統(tǒng)的血清(xuqng)溶血試驗具有更高的特異性與敏感性。 第六十五頁，共八十一頁。第六十六頁，共八十一頁。第六十七頁，共八十一頁。 血小板： 巨血小板 血小板無力(wl)癥 網織血小板流式細胞術與血小板第六十八頁，共八十一頁。血栓性疾與血栓前狀態(tài)： 由于(yuy)活

17、化血小板是血栓的主要成分之一，也是引起血栓形成的主要原因，所以血小板活化程度的增高與疾病的發(fā)生發(fā)展有關。第六十九頁，共八十一頁。流式細胞術與網織紅細胞第七十頁，共八十一頁。 DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是惡變細胞的重要標志， FCM在腫瘤學上的應用，主要是利用DNA含量(hnling)測定，進行癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導以及預后評估等工作。 癌前病變的癌變率與病變的增生程度一致，而增生程度與DNA含量的異常改變又呈平行關系。 流式細胞術與腫瘤(zhngli)第七十一頁，共八十一頁。 FCM通過精確定量DNA含量，能對癌前病變的性質和發(fā)展趨勢作出判斷，有助于癌前病變的早期診斷。 DNA倍體分

18、析(fnx)有助于臨界性腫瘤的診斷，如卵巢交界性腫瘤，異倍體的出現(xiàn)與病變的惡性發(fā)展有關。 第七十二頁，共八十一頁。 DNA異倍體、高S期細胞比值和高增殖細胞核抗原（PCNA）表達與細胞增殖能力、惡性程度(chngd)和不良預后呈正相關。 第七十三頁，共八十一頁。 為治療方案和藥理學研究提供依據(jù)：不同類型的腫瘤對化療藥物的敏感性不同?？衫肍CM進行細胞周期分析，適當選擇周期特異性藥物或非周期特異性藥物。 MDR是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白（P-gp）親脂化合物，包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。從人淋巴細胞(xbo)排除熒光染料與細胞(xbo)內P-gp的含量直接相關。當淋巴細胞出現(xiàn)MDR陽性細胞時，患者對化療藥物開始出現(xiàn)耐藥性，需要考慮其他治療方式。 第七十四頁，共八十一頁。流式細胞術與生殖(shngzh)醫(yī)學 正常男性(nnxng)精液中均為單倍體細胞，而由于精子發(fā)生障礙所致不育的男性(nnxng)精液中會出現(xiàn)大量2倍體和4倍體細胞。1