1、匯報人周亞濱匯報人周亞濱不穩(wěn)定型心絞痛猝 死急性心肌梗死穩(wěn)定型心絞痛預(yù)后良好不穩(wěn)定型心絞痛是穩(wěn)定型心絞痛至心肌梗死之間的中間狀態(tài)不穩(wěn)定型心絞痛猝 死急性心肌梗死穩(wěn)定型心絞痛預(yù)后良好Company Name黃芪、茯神、白茯苓、半夏曲、當歸、川芎各一錢半遠志、 酸棗仁、 辣桂、柏子仁、五味子、人參各一錢炙甘草半錢按以上比例取藥材養(yǎng)心湯 養(yǎng)心湯出自明代王肯堂的證治準繩雜病證治類方，主治心虛血少、驚惕不寧，歷代醫(yī)家多用該方治療心經(jīng)氣血不足引起的心悸、怔忡、胸痹心痛等。Company Namewww.themegallery.c生活質(zhì)量硝酸甘油用量養(yǎng)心湯不穩(wěn)定型心絞痛患者發(fā)作頻率疼痛程度減輕減少減少提高

2、前 期 實 驗 結(jié) 果生活質(zhì)量硝酸甘油用量養(yǎng)心湯不穩(wěn)定型發(fā)作頻率疼痛程度減輕減少減材料與方法材料與方法一. 實 驗 細 胞材料與方法人臍靜脈內(nèi)皮細胞一. 實 驗 細 胞材料與方法人臍靜脈內(nèi)皮細胞二. 實 驗 動 物材料與方法Wistar大鼠 購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心二. 實 驗 動 物材料與方法Wistar大鼠 購自黑龍三. 實 驗 藥 物養(yǎng)心湯浸膏加蒸餾水混懸液濃度60黃芪茯神白茯苓半夏曲當歸川芎各一錢半五味子酸棗仁辣桂遠志人參柏子仁各一錢炙甘草半錢材料與方法按以上比例取藥材三. 實 驗 藥 物養(yǎng)心湯浸膏加蒸餾水混懸液濃度60黃芪茯四. 主 要 試 劑人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液胰蛋白酶

3、30%H2O2溶液 胎牛血清 DMSO MTT 材料與方法四. 主 要 試 劑人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液材料與方法五. 主 要 儀 器紫外分光光度計倒置熒光數(shù)字成像顯微鏡凝膠成像儀離心機等材料與方法五. 主 要 儀 器材料與方法六、 細 胞 復(fù) 蘇 取出凍存管迅速置于37溫水中，快速使其內(nèi)容物融化。無菌條件下打開凍存管，用移液管輕輕吹打已解凍的細胞懸 液，反復(fù)吹打5次，將細胞移至已包含完全培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中，然后將培養(yǎng)瓶蓋旋緊輕輕的晃動培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶放 置在37培養(yǎng)箱24h后加入新鮮的人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，在細胞達到60%融匯之前，保持隔天換液的頻率；達到60% 后每天換液；當細胞達到8

4、0%融匯的時候，進行細胞傳代。材料與方法六、 細 胞 復(fù) 蘇 取出凍存管迅速置七、 細 胞 培 養(yǎng) 及 傳 代 細胞接近融合時，棄培養(yǎng)液，以 0.2胰蛋白酶消化。倒置顯微鏡下觀察，見細胞回縮、細胞間隙增大時，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，棄消化液終止消化，吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，接種。37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，4-5天傳代一次，傳3-5代備用。材料與方法七、 細 胞 培 養(yǎng) 及 傳 代 細胞接近融合八. 養(yǎng) 心 湯 含 藥 血 清 制 備 空白組隨機養(yǎng)心湯組1.02g/ml 2ml /100g同體積蒸餾水采血材料與方法八. 養(yǎng) 心 湯 含 藥 血 清 制 備 空白組隨機養(yǎng)心湯組九. 模 型 制 備 及

5、 分 組人臍靜脈內(nèi)皮細胞空白組養(yǎng)心湯含藥血清6%材料與方法模型組100 l 基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 l 基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 l H2O2培養(yǎng)液6 l養(yǎng)心湯血清 4 l胎牛血清90 l基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 l H2O2培養(yǎng)液九. 模 型 制 備 及 分 組人臍靜脈內(nèi)皮細胞空白組養(yǎng)心湯十、 觀 察 指 標 HUVEC形態(tài)學(xué)觀察養(yǎng)心湯含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HUVEC氧化損傷模型差異基因表達的影響材料與方法十、 觀 察 指 標 HUVEC形態(tài)學(xué)觀察材料與方法16基因篩選Affymetrix2302.0生物信息芯片掃描數(shù)據(jù)優(yōu)化數(shù)據(jù)庫差異基因分析聚類分析基因功能分析數(shù)據(jù)分析芯片 雜交、 洗脫、染色純化雙鏈cDNA總R

6、AN提取模型組空白組 養(yǎng)心湯含藥血清組18基因篩選Affymetrix生物信息數(shù)據(jù)分析芯片 雜交、十一、 統(tǒng) 計 學(xué) 處 理 采用SPSS13.0分析軟件，計量資料以s表示， 多組間比較應(yīng)用方差分析，兩兩比較應(yīng)用q檢驗。材料與方法十一、 統(tǒng) 計 學(xué) 處 理 采用SPSS13.0分析軟件，計結(jié) 果結(jié) 果1、各 組 HUVEC 細 胞 形 態(tài) 學(xué) 觀 察 空白組 模型組 結(jié) 果1、各 組 HUVEC 細 胞 形 態(tài) 學(xué) 觀 察 養(yǎng)心湯含藥血清組 結(jié) 果 養(yǎng)心湯含藥血清組2、各組RNA電泳結(jié)果 表 1 各 組 RNA 電 泳 結(jié) 果分組樣品狀態(tài)A260/280A260/230濃度（g/L）總量（g）

7、電泳結(jié)果養(yǎng)心湯含藥血清組TRIzol1.990.800.19215.4RNA可用模型組TRIzol1.930.490.18714.9RNA可用空白組TRIzol1.890.860.17614.1RNA可用結(jié) 果2、各組RNA電泳結(jié)果 表 1 各 組 RNA 電 泳 結(jié)結(jié) 果圖1示各組RNA電泳圖1：養(yǎng)心湯含藥血清組；2：模型組；3：空白組 結(jié) 果圖1示各組RNA電泳圖3.養(yǎng)心湯含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HUVEC 氧化損傷模型的差異基因表達的影響表 2 基 因 芯 片 的 表 達 結(jié) 果分組P(Present)M(Marginal)A(Absent)養(yǎng)心湯含藥血清組25421（46.50%）816

8、（1.49%）28438（52.01%）模型組24931（45.60%）733（1.34%）29011（53.06%）空白組25534（46.70%）729（1.33%）28412（51.97%）結(jié) 果3.養(yǎng)心湯含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HUVEC 氧化損傷模上調(diào)84，下調(diào)48模型組與空白組比較上調(diào)1371 ，下調(diào)274養(yǎng)心湯含藥血清組與空白組比較養(yǎng)心湯含藥血清組與模型組比較 上調(diào)1162 ，下調(diào)86下調(diào)上調(diào)12條上調(diào)下調(diào)23條表達趨勢相同35條上調(diào)84，下調(diào)48模型組與空白組比較上調(diào)1371 ，下調(diào)27討 論討 論減輕疼痛程度減少發(fā)病頻率減少了硝酸甘油的用量降低心律失常發(fā)生機率提高生活質(zhì)量益氣養(yǎng)

9、血、養(yǎng)心安神是UA的重要治療方法根據(jù)主方治療UA 陰陽平衡理論養(yǎng)心湯加減討 論1、養(yǎng)心湯減輕疼痛程度減少發(fā)病頻率減少了硝酸甘油的用量降低心律失常發(fā)生以人參、黃芪合用大補元氣，以扶心氣方中選用大量安神之品，茯苓、茯神、遠志健脾和胃，補心安神；柏子仁、酸棗仁、五味子，斂心氣而養(yǎng)心神。當歸、川芎、半夏等行氣活血化痰祛瘀，與補氣養(yǎng)心之藥配伍，補中有通，氣復(fù)血行。討 論以人參、黃芪合用大補元氣，以扶心氣方中選用大量安神之品，茯苓這是本方劑治療UA的獨到之處。而且在臨床應(yīng)用取得了滿意的療效，顯示出中醫(yī)調(diào)整陰陽治療大法的有效性。 肉桂甘草辛甘養(yǎng)陽陽氣得復(fù)，心神得安五味子酸棗仁酸甘化陰既斂心氣，又安心神陰陽平

10、衡氣血調(diào)和川芎當歸半夏活血化痰通則不痛，從而心神得安，疼痛得減討 論這是本方劑治療UA的獨到之處。而且在臨床應(yīng)用取得了滿意的療效2、關(guān)于養(yǎng)心湯含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HUVEC 氧化損傷模型差異基因表達的影響經(jīng)MAS分析和文獻查閱，分子功能與ATP結(jié)合有關(guān)的基因是ATP7A等；與蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)的基因有ALB等，與肌動蛋白結(jié)合有關(guān)的基因有DST 等；與蛋白激酶結(jié)合有關(guān)的基因有PRKAB2；與蛋白酪氨酸激酶活性有關(guān)的基因有PLK4。這些蛋白是細胞生存所依賴的，這些基因參與細胞合成、代謝、細胞信息傳遞、細胞內(nèi)外物質(zhì)交換及生命物質(zhì)的合成。 討 論2、關(guān)于養(yǎng)心湯含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HUVEC 分子功能與

11、血小板活化有關(guān)的基因有CD9，CD9是分子量為24KD的糖蛋白，屬于跨膜4超家族（TM4SF）成員廣泛分布于血小板、前B細胞、單核細胞等造血細胞及一些非造血組織細胞，CD9可與活化的血小板中GPb/a相連接，從而對血小板的凝聚功能起調(diào)控作用。討 論 分子功能與血小板活化有關(guān)的基因有CD9，CD9 本實驗中模型組CD9表達較空白組上調(diào)，表明H2O2對內(nèi)皮細胞造成損傷后，引起血小板聚集到受損的內(nèi)皮細胞上，從而促進PDGF的釋放，導(dǎo)致肌內(nèi)膜細胞不斷增生，最終導(dǎo)致膠原合成，形成AS斑塊。養(yǎng)心湯含藥血清干預(yù)后， CD9表達較模型組下調(diào)，表明養(yǎng)心湯含藥血清具有抑制血小板聚集，能夠有效的防治UA。討 論 本

12、實驗中模型組CD9表達較空白組上調(diào)，表明H2O2對內(nèi)皮討分子功能與細胞黏附有關(guān)的基因有JAM2，JAM為連接黏附分子，是屬于免疫球蛋白超家族（IgSF）的一類整合膜蛋白, 包括JAM-1、JAM-2和JAM-3。JAM分布于上皮細胞和內(nèi)皮細胞的緊密連接處以及血小板、白細胞和紅細胞的膜表面及淋巴管內(nèi)皮細胞，參與內(nèi)皮細胞之間連接復(fù)合物的構(gòu)成，介導(dǎo)細胞之間的黏附，在細胞間連接黏附起重要的作用。討 論分子功能與細胞黏附有關(guān)的基因有JAM2，JAM為連接討 大量離體和在體實驗證明，組胺、緩激肽、氧自由基、 腫瘤壞死因子、白介素-8等炎癥介質(zhì)和細胞因子均可 誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞肌動蛋白骨架重組、緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，

13、 使大分子物質(zhì)通過增大的細胞間隙轉(zhuǎn)移致內(nèi)皮下或血 管外。討 論 大量離體和在體實驗證明，組胺、緩激肽、氧自由基、討 本實驗中模型組JAM2表達較空白組下調(diào)，表明H2O2作用于HUVEC，使緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)皮細胞通透性增高，其屏障作用受損。養(yǎng)心湯含藥血清組JAM2表達較模型組上調(diào)，表明養(yǎng)心湯含藥血清能夠降低內(nèi)皮細胞通透性，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定而發(fā)揮對內(nèi)皮細胞屏障作用的保護作用。本實驗中模型組JAM2表達較空白組下調(diào)，表明H2O235分子功能生物進程與負調(diào)控細胞增殖、細胞生長有關(guān)的基因有SAMD4，Smad4蛋白作為序列保守的smads蛋白家族的一員，其是TGF-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心分子，主要功能是參與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-)超家族細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。所有生物學(xué)效應(yīng)均是Smad4與不同的SmadS蛋白相互作用的結(jié)果。37分子功能生物進程與負調(diào)控細胞增殖、細胞生長有關(guān)的36本實驗中模