1、重組蛋白質(zhì)的分離純化更多更快更純2022/9/13蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的基本流程選擇要研究的蛋白克隆表達(dá)目的蛋白分離純化重組目的蛋白測(cè)定蛋白溶解性穩(wěn)定性大量純化表達(dá)目的蛋白通過(guò)各種結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法解析目的蛋白結(jié)構(gòu)核磁晶體冷凍電鏡蛋白功能研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系藥物開(kāi)發(fā)2022/9/13結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)樣品的要求蛋白濃度：10-15 mg/ml蛋白純度：95%蛋白構(gòu)象均一：?jiǎn)误w，二體，多聚體蛋白具有活性在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中，重組蛋白表達(dá)純化至關(guān)重要！ 更多更快更純2022/9/13 純化策略 更多更快更純2022/9/13實(shí)驗(yàn)室常用的蛋白質(zhì)的 純化方法與檢測(cè)方法檢測(cè)方法： A280nm紫外吸收值； 考馬斯亮

2、藍(lán)； SDS蛋白凝膠電泳 凝膠過(guò)濾 疏水層系 離子交換 親和層系 反相層析 2022/9/13A280檢測(cè)原理：蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外280nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其光吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用280nm波長(zhǎng)吸收值大小來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)原理：每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3H 基團(tuán)，偏酸性，與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)結(jié)合?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在465nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比?？捡R斯亮藍(lán)R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去

3、，所以可以用來(lái)對(duì)電泳條帶染色。SDS原理：聚丙烯酰胺凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量的交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑（過(guò)硫酸胺或核黃素）和加速劑（N， N，NN-四甲基乙二胺）的作用下聚合交聯(lián)成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠對(duì)樣品分子篩效應(yīng)：電場(chǎng)中，顆粒小、呈球形的樣品分子泳動(dòng)速度快；顆粒大、形狀不規(guī)則的分子通過(guò)凝膠空洞時(shí)受到的阻力大，泳動(dòng)慢。不論經(jīng)過(guò)多少步純化，最后都要根據(jù)SDS來(lái)檢測(cè)蛋白的純度！2022/9/13鎳柱的原理與發(fā)展Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有His（組氨酸）標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合，組蛋白標(biāo)簽一般是6個(gè)組氨酸(堿性氨基酸)。在蛋白上樣后，帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni-NTA純化介質(zhì)是Ni離子金屬螯合介質(zhì)。His-Tag融合蛋白是目前最常見(jiàn)的表達(dá)方式，而且很成熟，它的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)方便而且基本不影響蛋白的活性，無(wú)論是表達(dá)的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜去（IMAC）純化。組氨酸 咪唑富集作用強(qiáng)！2022/9/13三步純化步驟的邏輯組合2022/9/13總結(jié)蛋白純化對(duì)于結(jié)