1、PAGE 15 -細胞外基質(zhì)與多囊腎病發(fā)生發(fā)展之間的關系【關鍵詞】多囊腎病(PKD);多囊蛋白(PC);細胞外基質(zhì)重構多囊腎病(polycystickidneydisease，PKD)是一種與腎小管上皮細胞異常增殖，內(nèi)含液體的囊泡形成與增大以及細胞外基質(zhì)異常有關的疾病1。常染色體顯性遺傳PKD(autosomaldominantpolycystickidneydisease，ADPKD)的發(fā)病率介于1/10001/400，是最常見的一種PKD2，占我國終末期腎衰竭病因的第4位。至少有3種基因Pkd1、Pkd2、Pkd3突變可以引起ADPKD，其中85%是由Pkd1突變引起的。Pkd1基因表達產(chǎn)

2、物為多囊蛋白-1(PC1)，目前認為PC1結構功能缺陷是腎囊泡發(fā)生和發(fā)展的主要原因。斑馬魚實驗模型研究提示，與人類PKD基因高度同源的pkd1a/b和pkd2與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的分泌和裝配有關，從而改變基質(zhì)完整性，這可能是ADPKD病變中的病理學基礎之一3。以人類ADPKD腎為材料，采用標準EnVision免疫組織化學方法(又稱ELPS法)的研究表明，PC1的異常表達可以引起多種細胞外基質(zhì)的異常4。PC1具有特殊的胞外功能域，這些功能域被證明與多種細胞外基質(zhì)組分有聯(lián)系。近期研究者們綜合應用多種方法研究細胞外基質(zhì)與多囊腎病發(fā)展的關系，并試圖通過調(diào)控

3、細胞外基質(zhì)的重構，抑制多囊腎病的病程發(fā)展，許多抑制細胞外基質(zhì)重構的藥物也應用于動物ADPKD模型中。本文將從PC1結構和功能，PC1與細胞外基質(zhì)的聯(lián)系，細胞外基質(zhì)與ADPKD發(fā)展的相互影響和通過影響ECM重構而在ADPKD病程發(fā)展中起抑制作用的藥物幾方面介紹細胞外基質(zhì)與多囊腎病的發(fā)生發(fā)展之間的關系。1多囊蛋白1(PC1)1.1PKD基因?qū)唏R魚的PKD1同源基因pkd1ab敲除引起背軸彎曲、腦積水、軟骨和顱側(cè)缺陷，前腎低頻率(10%15%)的囊泡形成。在敲除PKD2基因的個體中則重點表現(xiàn)為背軸異常彎曲。研究提示ipkd1a/b和pkd2與調(diào)節(jié)ECM分泌和裝配有關，從而改變基質(zhì)完整性，這可能是A

4、DPKD病變中的基礎缺陷之一3。1.2PC1的結構與功能PC1功能域中包括位于N端附近的兩個富含亮氨酸的重復序列(LRR)，其兩端分別為富含半胱氨酸和羧基區(qū)域，合稱flank-LRR-flank。flank-LRR-flank排列與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間聯(lián)系密切相關5。還包括一個糖基化的C型凝集素功能域。15個Ig樣重復序列連續(xù)排列于C型凝集素功能域C端，另外一個Ig樣重復序列則位于C型凝集素功能域N端一側(cè)。緊接著15個Ig樣片段C端處的是4個纖連蛋白3型相關序列。此外，發(fā)現(xiàn)在凝集素和Ig樣重復之間存在一個富含半胱氨酸的，低密度的脂蛋白A功能域6。在正常情況下，這些功能域排列于細胞外并且參與細胞-細

5、胞或細胞-基質(zhì)間聯(lián)系。2PC1與ECM的聯(lián)系2.1PC1與信號轉(zhuǎn)導近期研究顯示ADPKD腎中的失去極性的上皮細胞可以異常表達上皮生長因子受體和具有Na+-K+-ATP酶活性的膜蛋白7。這種異常表達是由于胚胎基因ErbB2和Na+-K+-ATP酶-2亞基基因沒有正常關閉所致。有學者提出一種可能的模型，認為PC1參與了上述基因的表達調(diào)控8。根據(jù)這個模型，正常情況下，PC1通過與細胞外成分結合而獲取信息，并通過其C端磷酸化信號傳導調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。在ADPKD細胞中缺乏這種信號級聯(lián)反應，引起基因轉(zhuǎn)錄異常導致腎的異常發(fā)育。在PC1與基質(zhì)配體，比如整合素簇和粘著斑復合體結合后，這些配體被酪氨酸蛋白激酶如粘著

6、斑激酶和Src磷酸化而產(chǎn)生活性，進一步引起下游的級聯(lián)反應影響活性基因調(diào)控蛋白(activegeneregulatoryprotein,AP-1)依賴型基因的轉(zhuǎn)錄9。除了通過調(diào)控AP-1依賴型基因的轉(zhuǎn)錄，PC1還被發(fā)現(xiàn)能通過wnt通路調(diào)節(jié)TCF依賴型基因的轉(zhuǎn)錄。PC1抑制中間轉(zhuǎn)導物糖原合酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3，GSK-3)的磷酸化，從而導致-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性增加而積聚，-連環(huán)蛋白又可以與轉(zhuǎn)錄因子TCF結合成為復合體，從而激活TCF反應性基因的轉(zhuǎn)錄10(見圖1)。圖1PC1通過c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)途徑調(diào)節(jié)

7、AP-1類基因的表達以及通過Wnt途徑調(diào)節(jié)TCF反應性基因的表達哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白簡稱mTOR，此通路在正常情況下被抑制，在ADPKD中則被激活，mTOR影響膠原蛋白的合成與穩(wěn)定,并與TGF-和v3整合素信號通路相互作用,影響細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。PC1可以調(diào)節(jié)mTOR和轉(zhuǎn)錄因子STAT6通路。薯球蛋白是結節(jié)性硬化基因-2(tuberoussclerosis2,TSC2)的編碼產(chǎn)物，是mTOR途徑中的重要調(diào)節(jié)因子。mTOR活性依賴于小片段G蛋白的GTP結合狀態(tài)，薯球蛋白通過其GAP功能域調(diào)節(jié)這些小片段的GTP/GAP狀態(tài)發(fā)揮功能。GAP有活性的前提是與錯構素(一種PKD1編碼產(chǎn)物)結合形成復

8、合物，這種薯球蛋白-錯構素復合物在正常情況下抑制mTOR11，12。ADPKD中PKD1的突變或缺失導致薯球蛋白呈游離狀態(tài)，并可以作為Akt和RSK1等激酶的底物而激活mTOR。這又會引起上皮細胞對生長因子的敏感度上升而激活PI3K或Erk通路。EGF受體信號導致的Erk激活已經(jīng)在多種人類和動物的囊化性疾病中有所記錄13。2.2PC1與細胞外基質(zhì)組分的關系有學者提出PC1作為細胞外基質(zhì)受體通過粘著斑蛋白聯(lián)系ECM與肌動蛋白細胞骨架。免疫共定位和免疫共沉淀結果表明在正常胚胎腎和亞融合上皮細胞培養(yǎng)中，PC1與21整合素、踝蛋白(talin)、紐帶蛋白(vinculin)、樁蛋白(paxillin)

9、、P130cas、粘著斑激酶和c-src形成多蛋白復合物。在正常成人腎和融合上皮培養(yǎng)中，PC1表達下調(diào)并與E-鈣粘素和、-連環(huán)蛋白形成細胞之間連接。抑制酪氨酸磷酸化和細胞內(nèi)鈣離子濃度上升引起PC1-黏著斑蛋白復合物相對于細胞間連接復合物增多10。用酪氨酸磷酸化抑制劑處理細胞后，PC1與FAK的聯(lián)系被切斷，同時PC1與-連環(huán)蛋白連接，提示PC1通過酪氨酸磷酸化而調(diào)節(jié)細胞分化14。在發(fā)育和突變的過程中，PC1的分布由細胞-基質(zhì)粘合轉(zhuǎn)向細胞間連接。提示PC1可能以此方式調(diào)控細胞分化。從結構上講，除了PC1N端富含半胱氨酸的區(qū)段被發(fā)現(xiàn)與多種粘著斑蛋白有關聯(lián)。對PC1Ig樣功能域序列10的核磁共振結構分

10、析表明，從人類到河豚中均有一個Ig樣折疊也可以與細胞外基質(zhì)結合15。此外，PC1最末端的1000AA序列與海膽卵膠受體有高度同源性，其功能不清。近期，海膽卵膠受體(REJ)家族的其他成員在人類睪丸中被發(fā)現(xiàn)16。盡管PC1中此功能域的作用尚不清楚，但在海膽中它與精卵接觸后，鈣離子流入從而改變精子膜結構以受精中起到作用?？赡茉赑C1中此結構也有類似的介導鈣離子流入的功能。鈣離子濃度的變化又可以調(diào)節(jié)多種下游級聯(lián)反應的發(fā)生與程度，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化。ADPKD細胞中，細胞內(nèi)鈣離子濃度降低也是其過度增殖和低分化產(chǎn)生的原因之一。3多囊蛋白-2(PC2)與細胞外基質(zhì)多囊蛋白-2(PC2)是定位于4q1

11、222的另一種多囊腎基因PKD2的編碼產(chǎn)物。盡管PC2結構中有多個功能域與PC1同源，但與PC1不同的是，PC2的N端和C端都位于細胞內(nèi)。盡管人們對PC2的結構還不是很清楚，但人們假定PC2的C端存在一個特殊的盤繞的功能域，PC2通過此功能域與PC1相連17。在PC2的C端發(fā)現(xiàn)了一個EF手樣的基序。EF手樣基序包含多個鈣離子結合位點并，并可能以單體或多體形式存在并根據(jù)其結構不同，發(fā)揮催化酶促反應或調(diào)解細胞內(nèi)鈣離子水平的作用。另外，TsiokasL等在1999年發(fā)現(xiàn)PC2和與果蠅基因TRPC同源基因編碼的鈣離子流入通道相連18，這種表達產(chǎn)物在哺乳動物表現(xiàn)為一種非選擇性的，鈣離子可滲透的陽離子通道

12、，允許鈣離子流入細胞。對PC2功能的理解不像PC1那么深入。除了與PC1共同形成復合體調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子水平以外，近期的多項研究表明，除了與PC1相關的功能，PC2本身也有許多作用。比如關于信號轉(zhuǎn)導的研究發(fā)現(xiàn)，PC2可以像PC1一樣，激活AP-1依賴型基因的轉(zhuǎn)錄。與PC1不同的是，它不僅可以通過c-Jun終端激酶途徑達到此功能，也可以通過絲裂原激活的蛋白激酶途徑。后一種途徑可以被鈣離子非依賴性的PKC調(diào)控19。另外，PC2被發(fā)現(xiàn)與Hax2,一種與肌動蛋白細胞骨架相連的蛋白質(zhì)有聯(lián)系20。這些都提示PC2可能通過調(diào)控蛋白質(zhì)合成等方式與ECM聯(lián)系，但對PC2的結構功能還需要更多的研究。4細胞外基質(zhì)和A

13、DPKD發(fā)展的相互影響4.1細胞外基質(zhì)重構ECM發(fā)生重構是ADPKD發(fā)展的標志性改變之一。ECM調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化可能是通過直接作用和間接作用。多數(shù)構成ECM成分的分子結構中均有促進細胞分裂的EGF樣功能區(qū)。在正常情況下，ECM的EGF功能區(qū)遮蔽，在創(chuàng)傷后被暴露，刺激細胞分裂。體外實驗證明：層連蛋白LN的EGF樣結構能促進成纖維細胞和表皮細胞的增殖。一些ECM分子如珍珠素和修飾素能與細胞因子結合，不僅具有貯存細胞因子的作用，而且有調(diào)節(jié)這些細胞因子活性的作用，從而間接調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化。Candiano等發(fā)現(xiàn)在富含一型膠原的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MDCK細胞形成囊泡，提示細胞外基質(zhì)中的某些膠原成分可

14、能與囊泡形成發(fā)展有密切聯(lián)系21。另一方面，隨著ADPKD的發(fā)展，囊泡中液體不斷滲出，體積增大。隨著囊泡生長和液體堆積，相連的細胞外基質(zhì)開始進行重構。在單層培養(yǎng)的MDCK細胞中，牽拉細胞膜下的支持物可以引起細胞增殖。此外，上皮細胞表面的初級纖毛也通過調(diào)節(jié)某些基質(zhì)蛋白的表達而參與此過程。腎的纖毛是由微管構成的，黏著于小管和集合管膜表面的突出物。它被報道可以對細胞內(nèi)上升的鈣離子流入感應并反應22。許多研究表明PC1和PC2位于初級纖毛，并可以作為短暫的有通道潛力的受體，感受并調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度。纖毛彎曲引起鈣離子通過PC2的通道流入細胞內(nèi)23。這種感知能力在PC1突變的細胞中消失了。許多PKD有關

15、的細胞功能，比如包括基質(zhì)蛋白基因在內(nèi)的基因表達，細胞周期，分化與凋亡，都被細胞內(nèi)鈣離子濃度所調(diào)節(jié)。纖毛的功能異常與細胞周期的持續(xù)進行有很大關系。PC1通過上調(diào)p21激活JAK-STAT途徑，導致細胞周期停滯于G0/G124。纖毛上的IFT88/POLARIS蛋白被證明與細胞周期過渡中中心體密切相關。它的過度表達可以阻止G1/S過渡并誘導細胞凋亡。相反，其表達缺失則引起細胞周期持續(xù)進行25。PC2同樣可以通過與Id2，一種螺旋-環(huán)-螺旋家族蛋白(可調(diào)控細胞增殖分化)的連接而調(diào)節(jié)細胞周期。在PC結構被描述之前，人們就假定細胞基底膜連接的改變可能是PKD的主要病變。現(xiàn)在有充分的證據(jù)證明在多數(shù)ADPK

16、D中，基本的缺陷在于細胞-細胞/基質(zhì)連接蛋白。小管上皮細胞和ECM具有相反的序列以相互連接。ECM與細胞之間的聯(lián)系被破壞可以引起細胞異常分化，就像ADPKD中的異常分化。PC在細胞-基質(zhì)連接中起到重要作用并可能直接于ECM組分相連，通過胞質(zhì)區(qū)介導上皮細胞通訊26。4.2細胞外基質(zhì)/血管硬化近期，基質(zhì)血管硬化也被證明與包括ADPKD在內(nèi)的慢性腎病(chronickidneydisease，CKD)有密切關系，成為一個新的研究熱點。CKD病人的血管鈣化率比同年齡組的血管造影術確診患有冠狀動脈疾病的患者高25倍。在CKD中基質(zhì)血管硬化的病理機制尚未被完全弄清，但有一些實驗結果可以提示一些相關的危險因

17、素。在CDK中，電解質(zhì)代謝異常，骨營養(yǎng)不良可能和血管鈣化有關，大多數(shù)CKD患者的副甲狀腺激素和磷的水平都比一般人高。用磷酸鹽結合劑抑制胃腸道吸收磷并用維生素D抑制副甲狀腺激素的分泌，剛開始，病人表現(xiàn)為低血鈣，但再給予鈣離子后，又表現(xiàn)出高血鈣27。用不含鈣的磷酸鹽結合劑治療CKD小鼠與含鈣的磷酸鹽結合劑相比可以降低動脈鈣化，提示在CKD引起血管鈣化的過程中，鈣離子的過度攝入可能是一個重要病理機制。在動脈鈣化的過程中，一個基本基質(zhì)便是血管平滑肌(VSMCs)向成骨細胞分化，而這一分化過程可能是通過上調(diào)核結合因子-1(Cbfa1)的表達而實現(xiàn)的，因為缺失Cbfa1的小鼠表現(xiàn)為不能實現(xiàn)骨礦化28。在從

18、進行腎透析的CKD病人獲得的上腹部動脈的組織學切片中，研究組發(fā)現(xiàn)了Cbfa1和多種骨相關蛋白(骨橋蛋白、骨唾液酸糖蛋白、堿性磷酸酶和一型膠原)的表達29，提示這也可能是CKD病人發(fā)生基質(zhì)血管硬化的基質(zhì)之一。4.3細胞外基質(zhì)的炎癥反應和纖維化有越來越多的證據(jù)表明，間質(zhì)炎癥反應和纖維化在CKD腎功能損傷中起到重要作用。炎癥反應和間質(zhì)纖維化壓迫束緊了腎小管和小管周圍的毛細血管，導致其發(fā)生萎縮并與相應腎小球分離。同時，腎小管與毛細血管的間隔擴大，氧的擴散變得愈發(fā)艱難，最終導致組織缺氧受損，而缺氧又進一步刺激炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，肌成纖維細胞聚集和膠原沉積30。此外，炎癥細胞的聚集還可以通過破壞腎小球血管對于

19、系統(tǒng)性高血壓的自動調(diào)節(jié)基質(zhì)而引起其損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，小管間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞聚集與腎小球入球小動脈發(fā)生增殖性表型有關，導致ECM的重構并降低血管平滑肌對于收縮性刺激的反應。隨著慢性腎病的發(fā)展，腎小球濾過屏障受損，導致蛋白尿。蛋白尿不僅是腎小球病變引起的一種癥狀，反過來也可以成為非糖尿病性慢性腎病進展的一個獨立危險因素。近年來研究提示尿蛋白在經(jīng)過腎小管時，可通過直接毒性作用和激活補體兩種方式導致腎小管間質(zhì)纖維化。尿中的白蛋白被近端小管上皮攝入后，可產(chǎn)生活性氧分子激活NF-B，后者作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控包括TGF-1、IL-8、趨化因子等炎癥細胞因子的表達。蛋白尿性腎病的患者和小鼠腎小管刷狀緣有C3和C5b-

20、9沉積，提示蛋白尿與補體激活相關31。研究顯示，C3裂解產(chǎn)物C3a不僅可以促進炎癥細胞的聚集，還可以與通過小管上皮表面受體直接作用，上調(diào)一型膠原蛋白表達而促進纖維化。而C5b-9具有上調(diào)小管細胞內(nèi)四型膠原蛋白表達和促進肌成纖維細胞向小管聚集的作用32。5以細胞外基質(zhì)重構為作用靶點的藥物5.1基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)抑制劑MMPs是一類在細胞外基質(zhì)成分重構和溶解多種細胞表面蛋白質(zhì)中起到重要作用的蛋白酶大家族。MMPs是一種鋅依賴的蛋白酶家族，可以分解多種細胞外基質(zhì)組分，同時促進細胞增殖遷移。在正常組織中，MMPs表達量很少;但當發(fā)生組織損傷時，

21、其表達量可以大幅上升。在發(fā)生進行性病變腎組織中，MMPs可能對膠原-整合素聯(lián)系起到調(diào)節(jié)作用，從而產(chǎn)生對腎基底膜重構起關鍵作用的蛋白溶解過程33。有許多研究結果表明MMPs通過調(diào)節(jié)基質(zhì)蛋白的合成分解促進多囊腎病的發(fā)展：從C57BL/6J-cpk鼠身上取得的腎小管含有比正常鼠更高水平的MMP-2和-934。PKD病人血清中MMP-1、-9和金屬蛋白酶抑制劑-1的水平顯著高于健康人。MMP-14mRNA在Han:SPRD大鼠囊化的上皮和遠端小管高表達。在急性缺血性腎衰竭(IRI)和輸尿管損傷中均出現(xiàn)細胞外基質(zhì)積聚的現(xiàn)象?；|(zhì)金屬蛋白酶被證明與腎IRI和ADPKD病變有關。用MMP抑制劑巴馬司他處理H

22、an:SPRD-cy/+大鼠可以顯著減少囊泡數(shù)量和腎重量35，提示MMP抑制劑可能是PKD的有潛力治療方法。5.2膠原抑制劑膠原基因在胚胎初始階段高度表達，待組織形成后表達關閉。缺乏多囊蛋白PC1和/或PC2，胚胎期的基因表達不能適當?shù)仃P閉。PC缺陷的斑馬魚癥狀可以被多種膠原生成或交聯(lián)抑制劑所緩解。氨酰氧化酶抑制劑MCP和APN在斑馬魚胚胎可以抑制膠原交聯(lián)。PI3K抑制劑渥曼青霉素和LY294002溶解于DMSO對斑馬魚胚胎脊索col2a1(一種膠原合成基因)基因表達起到抑制作用10。5.3雷帕霉素研究表明，雷帕霉素作為一種mTOR通路抑制劑可以延緩Han:SPRD小鼠的囊泡生長36。其主要作

23、用原理是抑制了mTOR通路關鍵因子S6K的磷酸化而使之失活。雷帕霉素是一種有抗增殖和抑生長作用的免疫抑制劑，臨床上用于預防同種異型排斥反應。5.4免疫抑制劑細胞外基質(zhì)的炎癥反應和纖維化在腎功能缺陷進程中起到重要作用。免疫抑制劑可以通過抑制炎性因子的產(chǎn)生和作用而起到減緩ADPKD進程的作用。例如甲基潑尼松龍可以起到抑制pcy小鼠和Hart：SPRD大鼠的ADPKD進程，包括抑制囊泡擴大，抑制間質(zhì)纖維化和保護腎功能的作用37。6總結ADPKD是一種進行性慢性腎病，終末期導致腎功能衰竭?，F(xiàn)今，ADPKD的治療僅限于透析和移植。在ADPKD發(fā)病機制中，起重要作用的是多囊蛋白-1，而PC1與細胞外基質(zhì)之

24、間關系密切?；趯毎|(zhì)基質(zhì)和多囊腎病發(fā)展相互關系的理解，為今后研究治療PKD藥物提供了新的藥物作用靶點?！緟⒖嘉墨I】1ArnouldT，KimE，TsiokasL.Thepolycystickidneydisease1geneproductmediatesproteinkinaseCdependentandc-junN-terminalkinase-dependentactivationofthetranscriptionfactorAP1,1998.2TorresVE.TreatmentstrategiesandclinicaltrialdesigninADPKD.AdvChronicKi

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