1、 實(shí)驗(yàn)十一 線粒體的分離及活性測定線粒體是真核細(xì)胞的一個(gè)重要細(xì)胞器，好氧生物細(xì)胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供給，而線粒體是細(xì)胞內(nèi)唯一有氧呼吸的場所，因此，人們就一細(xì)胞“動(dòng)力站”之稱。線粒體結(jié)構(gòu)和功能上的研究至今一直是一個(gè)非常活躍的領(lǐng)域，本試驗(yàn)在于學(xué)會(huì)分離線粒體和測定線粒體活力，以高活力的線粒體制劑用于各種目的的研究。一、儀器與設(shè)備：1.冰凍高速離心機(jī)，或萬轉(zhuǎn)/分離心機(jī)。2.組織搗碎機(jī)或勻漿器。3.冰浴，研缽、漏斗、紗布（尼龍布）、量筒、微量注射器、移液管、試管等。4.瓦氏呼吸器（氧極普測試系統(tǒng)）。5.顯微鏡、冰浴。6.分光光度計(jì)。二、材料與試劑：1.絕大多數(shù)的動(dòng)植物材料通常都可以制備線粒體，

2、但最好是生活力強(qiáng)，生長旺盛，幼嫩組織為好，如心肌、肝臟、骨骼肌、黃化幼苗、塊根、塊莖等。2.TriS-HCl（0.05M，pH7.2）緩沖液。3.磷酸緩沖液（0.2M，Ph7.2）。4.提取洗滌液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（0.001M），TriS-HCl（0.01M，pH7.2）緩沖液。5.懸浮液（同試劑4，但不加BSA）。6.反應(yīng)液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl（10ml，pH7.2）、EDTA（0.2mM）、MgCl2（5mM）、TriS

3、-HCl（10mM，pH7.2）。7.反應(yīng)底物：酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。三、線粒體的分離：線粒體在離體條件先很容易受各種因素（物理和化學(xué)的）作用而失活，特別是膜的完整性極為重要，因?yàn)橹挥型暾木€粒體才能進(jìn)行有氧呼吸。所以在分離操作中要掌握以下幾個(gè)要點(diǎn)：1.整個(gè)過程要保持在低溫下（0-4 oC）進(jìn)行。2.要注意分離介質(zhì)的pH值，pH值應(yīng)和被采用的材料一致。3.搗碎時(shí)間要控制得當(dāng)，或勻漿適度，爭取獲得更多的完整線粒體。4.盡可能縮短分離時(shí)間，爭取在1-1.5小時(shí)操作完畢，以確保被分離線粒體的質(zhì)量。不同材料，在分離線粒體的程序上不同，下面列舉兔肝，鼠肝細(xì)胞線粒體和馬鈴薯塊莖制備線粒體

4、的分離程序。1.鼠肝細(xì)胞的線粒體分離程序：將大或小鼠斷頭處死后，盡可能快地取出肝組織放入預(yù)冷的蔗糖分離液中，洗滌，稱重，以每克肝組織加8倍分離液，勻漿。詳細(xì)步驟如下圖：2.馬鈴薯塊莖組織線粒體分離四、線粒體的形態(tài)鑒定活線粒體鑒定：用懸浮液制的1janus green B一滴，線粒體懸浮液0.51滴在載片上混合，靜止染色20分鐘后，在顯微鏡下檢查，線粒體衩染上蘭綠色，破了膜的線粒體不著色。電鏡觀察：把分離線粒體在4戊二醛中固定12小時(shí)，用0.2M磷酸鹽緩沖液洗12小時(shí)，再用餓酸固定一小時(shí)，用0.2M磷酸緩沖液洗滌1.5小時(shí)，然后依次以3050乙醇中各級(jí)脫水半小時(shí)，在70醋酸雙氧鈾預(yù)染1.5小時(shí)，

5、708095100乙醇中脫水各半小時(shí)，以上在冰浴中進(jìn)行，再在溫室下100乙醇中脫水至干凈后，用環(huán)氧樹脂，Epon812或618包埋，超厚切片后，電鏡檢查。線粒體腫脹檢查把分離線粒體在520nm下，測定光密度值（OD），腫脹線粒體數(shù)量高，OD值偏低。五、線粒體活力測定由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌衅湎鄳?yīng)指標(biāo)來鑒別線粒體活性：呼吸控制率（RCR），氧化磷酸化效率和32PiATP交換率可作為鑒定分離線粒體質(zhì)量指標(biāo)。呼吸控制北（RCR）和氧化磷酸化效率（P/O或ADP/O）測定。RCR是反映線粒體結(jié)構(gòu)的完整性及其功能的一個(gè)靈敏指標(biāo)，RCR是指加入ADP刺激后的呼吸（呼吸態(tài)）和ADP消耗后的呼吸（呼吸態(tài)）之比，即

6、RCRR/R，RCR值的大小，反映了線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度，離體的線粒體在測定呼吸時(shí)，不加底物下，也有微弱的耗氧，因此在氧電極記錄紙上有較低的斜率直線，這是由線粒體的內(nèi)源呼吸引起，所以稱為呼吸態(tài)，當(dāng)加入外源底物，酮戊二酸和氨基丁酸后，耗氧率迅速提高，此時(shí)下降的斜率稱謂呼吸態(tài)。當(dāng)加入ADP后呼吸耗氧率進(jìn)一步升高，此時(shí)下降斜率稱為呼吸態(tài)，當(dāng)磷酸化底物耗盡后，線粒體耗氧北又降低，此時(shí)斜率為呼吸態(tài)，所以根據(jù)呼吸改變即可以了解線粒體結(jié)構(gòu)完整性，電子傳遞及磷酸化偶聯(lián)狀態(tài)等。氧化磷酸化效率是指線粒體利用氧化釋放能量轉(zhuǎn)變換為ATP的效率，氧化磷酸化效率可用P/O或ADP/O來表示，P/O是指在某一氧化底物

7、存在下，消耗一克原子氧時(shí)，有多少克原子的無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為ATP。ADP/O指在同樣條件下，消耗1克原子氧，有多少克分子ADP轉(zhuǎn)化為ATP。按理論計(jì)算，酮戊二酸和氨基丁酸為底物時(shí)P/O或ADP/O值分別為2.4和3，將實(shí)測值和理論值相比，可檢查出分離線粒體的功能狀態(tài)。32PiATP交換活性測定這也是一個(gè)鑒別線粒體磷酸化偶聯(lián)活性指標(biāo)，交換活性大，線粒體偶聯(lián)磷酸化活力高。即線粒體質(zhì)量較好，用未被交換32Pi和鉬酸銨反應(yīng)生成鉬酸銨，再用分步有機(jī)溶劑萃取法提取，被交換的磷形成ATP則分配于水相中，然后由水相抽樣，用定標(biāo)器或液閃計(jì)數(shù)器測量其放射強(qiáng)度，再根據(jù)放射強(qiáng)度算出交換活性大小。六、測定RCR和ADP/O實(shí)

8、例：不同來源的的線粒體，其反應(yīng)液系統(tǒng)駐條件下不同，這里以黃化玉米苗線粒體為例。1.反應(yīng)液用前述反應(yīng)液，濕度25，氧極譜法。用注射器將1.8ml預(yù)保溫（25）的反應(yīng)液注入反應(yīng)室，打開攪拌器，待溫度恒定后，開啟記錄儀并調(diào)節(jié)靈敏度及零點(diǎn)，加入0.2ml線粒體制劑，此時(shí)的記錄斜率較低直線，為呼吸態(tài);待斜率穩(wěn)定后加入50ul底物酮戊二酸，此時(shí)的斜率為呼吸其質(zhì)存在時(shí)氧耗速率，稱呼吸態(tài);再加入1.2uM ADP，此時(shí)出現(xiàn)較大斜率，謂呼吸態(tài); ADP盡后線粒體耗氧速率自動(dòng)降低，稱呼吸態(tài)，如果加ADP又回到呼吸態(tài)。反應(yīng)結(jié)果ADP/O值計(jì)算：氧化磷酸化結(jié)果按圖，計(jì)算如下：線粒體控制的氧：ADP 加入ADP量（uM） O 所消耗氧量所消耗氧量U/XXV2U：每毫升溶液含UMO2量，25為260u mol/L。V：反應(yīng)液總體積為2ml。X：為2ml反應(yīng)液所含的溶解氧，相當(dāng)于記錄紙上幅度（80）Y：為R1格數(shù)（30格）Z：為由微克分子氧轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒖嗽訒r(shí)系數(shù)。所以耗氧量0.26/80303022=0.39則ADP/O1.2/0.393.08（或P/O3.08），RCRR/R=30格/14格2.14注意事項(xiàng)：（1）制備植物線粒體隨組織破碎，伴隨線粒體易膨脹，及內(nèi)源脂肪酸，酚類物物質(zhì)可抵制線粒體