1、流式細(xì)胞技術(shù)講義第1頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五需求帶來技術(shù)進(jìn)步ELISAWestern blotImmunoarrayBiological chips液相蛋白的定量定性檢測如何能夠一個樣品同時快速檢測多因子ELISA ?Flow cytometer?常用的檢測方法Needs rise to the evolution of science and techology! Method for quantification of liquid proteinELISAWestern blotImmunoarrayBiological chipsCommon Metho

2、dIs there a method that can quantify more than one analytes in one sample?ELISA ?Flow cytometer?第2頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五ContentApplication of easy-to-use analysis softwareAdvantages of flowcytomix techniqueIntroduction of Flowcytomix production Principle of Flowcytomix technology based on the

3、MicrospheresIntroductionPubulish paper 第3頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomix TechnologyThe FlowCytomix technology is based on the sandwich immunoassay technologyMicrospheres are used as a solid phase instead of a 96-well plate 20 different microsphere populations can be distinguished on a Flowcy

4、tometerEach bead population is coated with a specific antibody第4頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomix are Sandwich Immunoassays第5頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomix technical principle 20 different microsphere populations can be distinguished on a flowcytometer by2 different sizes9 and 11 diff

5、erent intensities of an internal dye (Starfire Red)Size ASize B第6頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五20 different Bead PopulationsWithin each set of beads (R1 or R2) distiguished by sizethere are 9 or 11 different bead populations distiguished by the respective intensity of the internal dye (Starfire Red)St

6、arfire Red measured in channel 3 or 4 of the flowcytomer distinguishes the different bead populations第7頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五AdvantagesImmunoassay for simultaneous detection of up to 20 analytesPossibility to mix and match allows the creation of customized panels Easy handling in 96 well plate

7、s or tubesRequires only 25 l of sample For serum, plasma and cell culture supernatantsBroad standard rangeCan be run on most commercially available flow cytometersComplimentary easy-to-use analysis software第8頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Reagents Provided in Different FormatMultiplex Kit up to 11 plex

8、Setup beadsmicrospheres coated with corresponding antibodiesreference standards for all cytokines (2 standard curves)detection antibodies, biotinylatedPE-labeled streptavidin96-well filter plateassay/wash buffer, CD-rom (software)Simplex Kitsmicrospheres coated with corresponding antibody reference

9、standard protein (2 standard curves)detection antibody, biotinylated Basic Kits (Buffer kit)Setup beadsPE-labeled streptavidinassay/wash bufferreagent dilution buffer96-well filter plateCD-rom (software)第9頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Simplex kits for HumanAdiponectinCD30CD40LCRPG-CSFIFN-alphaIFN-gamm

10、aIL-1 betaIL-2IL-4IL-5IL-6IL-8IL-10IL-12 p70IL-13IL-18TNF-alphaTNF-betaTNF-RLeptinMCP-1MIP-1 alphaMIP-1 betaMIGMPOOPGPAI-1ResistinT-PAsVCAM-1sPECAM-1sICAM-1sICAM-3sE-selectinsP-selectin第10頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五MouseGM-CSFIFN-gIL-1aIL-2IL-4IL-5IL-6IL-10IL-17TNF-aMCP-1MCP-3MIP-1 alphaMIP-1 betaR

11、ANTESRatGM-CSFIFN-gIL-1aIL-4MCP-1TNF-aSimplex kits for Mouse and Rat第11頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomix Multiplex Kits Human Th1/Th2 11plexBMS810FF (IFN-g, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-a, TNF-b)Human Adhesion 6plexBMS812FF (sE-selectin, sICAM-1, sICAM-3, sP-selectin,

12、 sPECAM-1, sVCAM-1)Human Cardiovascular 7plexBMS811FF (sCD40L, IL-6, IL-8, MCP-1, sP-selectin, t-PA, sVCAM-1)Human Chemokines 6plex BMS813FF (IL-8, MCP-1, MIG, MIP-1a, MIP-1b, G-CSF)Human Obesity 9plex BMS816FF (sCD40L, sICAM-1, IL-6, Leptin, MCP-1, MPO, OPG, Resistin, sTNF-R)第12頁，共52頁，2022年，5月20日，1

13、點31分，星期五FlowCytomix Multiplex KitsMouse Th1/Th2 10plexBMS820FF (GM-CSF, IFN-g, IL-1a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-a)Mouse Chemokines 6plex BMS821FF (MCP-1, MCP-3, MIP-1a, MIP-1b, Rantes, GM-CSF)Rat Th1/Th2 6plexBMS725FF (GM-CSF, IFN-g, IL-1a, IL-4, MCP-1, TNF-a)第13頁，共52頁，2022年，5月20日，1點

14、31分，星期五Vacuum Filtration ManifoldFiltration Manifold suitablePALLcat # P/N 5017BMS497FF Milliporecat.# MAVM 09601BMS499FF 第14頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Protocol for FlowCytomixFlowCytomix can be performed in a 96-well filter plate: bead washing require vacuum manifold or intubes: washing requires c

15、entrifugation 200g 5mins invert the tube carefullyPerformance in a 96-well plate has the following advantages:Washing process is much easier and fasterMulti-channel pipette can be usedBench time can be decreased by 70%第15頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Sample Volume RequiredHuman AnalyteFlowCytomixELISA

16、IFN-g25 l50 lIL-225 l50 lIL-425 l50 lIL-525 l50 lIL-625 l50 lIL-825 l50 lIL-1025 l50 lIL-12p7025 l25 lTNF-a25 l50 lTNF-b25 l100 ltotal25 l575 l第16頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Suitable SamplesSerumPlasmaCell culture supernatantsWhole BloodOther body fluids (e.g. synovial fluids, cerebrospinal fluid, b

17、ronchio-lavage fluid)第17頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomix is Suitable for most Flow CytometersThe flow cytometer needs to be equipped with one laser (488 nm or 532 nm) capable of detecting and distinguishing fluorescence emissions at 575 nm(PE) and685 nm - 690 nm ( starfire red )FlowCytomix su

18、itability has been tested for:BD FACScanBD FACS CaliburBD FACS CantoBC Epics XL BC FC500CyAn第18頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomixPro 2.2 SoftwareFlowCytomixPro Software allows easy analysis of the raw data (LMD data)The FlowCytomix software BMSFFS2.2 is included in every FlowCytomix Basic Kit a

19、nd FlowCytomix Multiplex KitsSystems required:on PC computers:Windows 98 or higher256 MB RAM (recommended: 512 MB RAM)Apple Macintosh: OS X or higherThe FlowCytomixPro Software is free of charge!第19頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Comparison: FlowCytomix and ELISA Precision:Coefficient of Variation: Flow

20、Cytomix: 10%ELISA: 10%Dilution Parallelism:FlowCytomix:88% - 113%ELISA:96% - 117%Standard Range:FlowCytomix:20000 28 pg/mlELISA:500 8 pg/ml(different in individual analytes)Specificity:FlowCytomix:no crossreactivityELISA:no crossreactivity第20頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Theoretical SensitivitySensiti

21、vity = The smallest detectable amount of the analyte in question: Analyte concentration resulting in a fluorescent intensity significantly higher than the blank (= mean + 2 standard deviations)Human AnalyteFlowCytomix, BMS810FF ELISAIL-1b 5.2 pg/ml 0.3 pg/mlIL-220.0 pg/ml15.0 pg/mlIL-415.7 pg/ml 2.0

22、 pg/mlIL-510.0 pg/ml 2.2 pg/mlIL-6 0.8 pg/ml 1.4 pg/mlIL-8 7.9 pg/ml11.0 pg/mlIL-10 1.5 pg/ml 2.0 pg/mlIL-12p7011.6 pg/ml 3.2 pg/mlIFN-g 2.2 pg/ml 1.5 pg/mlTNF-a17.5 pg/ml 5.0 pg/mlTNF-b 3.1 pg/ml 2.0 pg/ml第21頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Absolute Values of Samples第22頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Absolu

23、te Values of Samples第23頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Standard 10000 pg/ml Standard 3333 pg/ml Standard 1111 pg/mlStandard 370 pg/mlStandard 42 pg/mlStandard 14 pg/mlStandard BlankStandard 123 pg/ml第24頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Standard第25頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomix Specificity第26頁，共52頁，20

24、22年，5月20日，1點31分，星期五Kit Data + Software Manual (.pdf)New !New !FlowCytomix Pro 2.2 Short InstructionsFlowCytomix Pro 2.2 Software第27頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第28頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第29頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第30頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第31頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五S1S1S2S

25、2S3S3S4S4S6S6S7S7S8S8S5S5New !第32頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五S1S1S5S5S2S2S6S6S4S4S8S8S3S3S7S7New !第33頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第34頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第35頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第36頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第37頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第38頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第39頁，共

26、52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第40頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第41頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第42頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五第43頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New ! 53.23% 第44頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第45頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第46頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五New !第47頁，共52頁，2022年，5月20日，1點3

27、1分，星期五Published PaperCigarette smoke metal-catalyzed protein oxidation leads to vascular endothelial cell contraction by depolymerization of microtubules David Bernhard, Adam Csordas, Blair Henderson, Andrea Rossmann, Michaela Kind and Georg Wick Vascular Biology Group, Division of Experimental Path

28、ophysiology and ImmunologyDepartment BiocenterInnsbruck Medical University Innsbruck, Austria The FASEB Journal. 2005;19:1096-1107第48頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Published DataExperimental Set-up:HUVECs treated with cigarette smoke extract: Samples: cell supernatants of HUVEC sCD40L, t-PA, sVCAM-1, I

29、L-6, IL-8, MCP-1 was measured using FlowCytomix Results:第49頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五Published DataImpact of Interferon-Alpha in combined chemoradio immunotherapy for pancreatic adenocarcinoma (CapRI): First data from the immunomonitoringSchmidt J., Jger D., Bchler M. W., Mrten A.University of Hei

30、delbergDepartment of SurgeryCancer Immunol Immunother., 2006 Nov;55(11):1396-405 第50頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五FlowCytomix: published data Transforming growth factor beta induced FoxP3+ regulatory T cells suppress Th1 mediated experimental colitisFantini M.C., Becker C., Tubbe I., Nikolaev A., Lehr

31、 H.A., Galle P., Neurath M.F.University of Mainz, Laboratory of ImmunologyGut 2006, 55; 671-680. 第51頁，共52頁，2022年，5月20日，1點31分，星期五More Citations for FlowCytomix David Bernhard, Adam Csordas, Blair Henderson, Andrea Rossmann, Michaela Kind and Georg Wick. Cigarette smoke metal-catalyzed protein oxidati

32、on leads to vascular endothelial cell contraction by depolymerization of microtubules (2005). The FASEB Journal. 2005;19:1096-1107 (BMS711FF)Chan Siu Lung A., Yip Chun-Hung E., Yung Ying L., Pang H., Luk Chui-Wah S., Pang Fun S., Wong Hou Y. Immuno-regulatory effects of CKBM on the activities of mit

33、ogen-activated protein kinases and the release of cytokines in THP-1 monocytic cells. (2005). Biol Pharm Bull 28(9); 1645 1650. (BMS710FF)Fantini M.C., Becker C., Tubbe I., Nikolaev A., Lehr H.A., Galle P., Neurath M.F. Transforming growth factor beta induced FoxP3+ regulatory T cells suppress Th1 m

34、ediated experimental colitis (2006). Gut 55; 671-680. (IL-2, IL-6, IL-10, IFN-gamma Simplex Kits)Kozma N., Halasz M., Polgar B., Poehlmann T.G., Markert U.R., Palkovics T., Keszei M., Par G., Kiss K., Szeberenyi J., Grama L., Szekeres-Bartho J. Progesterone-Induced Blocking Factor Activates STAT6 vi

35、a Binding to a Novel IL-4 Receptor. (2006). The Journal of Immunology 176; 819 826. (BMS710FF)Munitz A., Bachelet I., Eliashar R., Moretta A., Moretta L., Levi-Schaffer F. The inhibitory receptor IRp60 (CD300a) suppresses the effects of IL-5, GM-CSF, and eotaxin on human peripheral blood eosinophils (2006). Blood 107(7); 2612. (BMS710FF)Rimoldi M., Chieppa M., Salucci V., Avogadri F., Sonzogni A., Sampietro G.M., Nespoli A., Vial