1、流式細(xì)胞技術(shù)和流式細(xì)胞儀第1頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四 本章內(nèi)容提要 概述 第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的工作原理 第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類與結(jié)構(gòu) 第三節(jié) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo) 第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除 第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用 本章內(nèi)容小結(jié)第2頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 流式細(xì)胞儀的定義流式細(xì)胞術(shù)的定義生物學(xué)顆粒的內(nèi)容流式細(xì)胞儀的發(fā)展史第3頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 流式細(xì)胞儀的定義:流式細(xì)胞儀是以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測

2、量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。 第4頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 流式細(xì)胞術(shù)的定義:應(yīng)用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞術(shù)。 第5頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)菌、霉菌、染色體、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、胞漿顆?；潭取NA含量、總蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜完整性和酶活性等。第6

3、頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 1934年：Moldavan1967年：Van Dilla 和Los Alamos 1965年：Kamentsky 1969年：Fulwyler利用Sweet 80年代 90年代第7頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 1934年Moldavan 使懸浮的血紅細(xì)胞從一個毛細(xì)玻璃管中流過，每個通過的細(xì)胞可被一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細(xì)胞儀的最初模型。 第8頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 1965年Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色的細(xì)胞，給出

4、了細(xì)胞中核酸的含量和細(xì)胞大小，奠定了多參數(shù)流式細(xì)胞測量的基礎(chǔ)。第9頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 1967年Van Dilla 和Los Alamos采用了Crosland-Taylor設(shè)計的層流流動室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的流式細(xì)胞儀，成為目前各種流式細(xì)胞測量儀的基礎(chǔ)。 第10頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 1969年Fulwyler利用Sweet的靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細(xì)胞分選術(shù)。Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細(xì)胞儀變成了低分辨率

5、的流式細(xì)胞儀。 第11頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 80年代以來，流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增多，新的熒光染料和細(xì)胞標(biāo)記物的出現(xiàn)，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大。 第12頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四概述 進入90年代，標(biāo)本制備儀和自動進樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細(xì)胞儀不僅出現(xiàn)在大專院校和科研單位，它也逐漸進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科。 第13頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的工作原理第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的工作原理 一、生物學(xué)

6、顆粒分析原理 二、細(xì)胞分選原理第14頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的工作原理1.樣品的進入流動室：將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進入流式細(xì)胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動。第15頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的工作原理2.鞘液的作用：流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。 第16頁，共7

7、4頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的工作原理3.信號的產(chǎn)生與接收：染色的細(xì)胞在測量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計算機儲存、計算、分析這些數(shù)字化信息，就可得細(xì)胞的大小和核酸含量等指標(biāo)。第17頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的工作原理 當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時，流式細(xì)胞儀就會在這類細(xì)胞形成液滴時給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。第18頁，共74頁，2

8、022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu) 一、流式細(xì)胞儀的分類 （一）流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng) （二）激光光源與光束成形系統(tǒng) （三）光學(xué)系統(tǒng) （四）信號檢測與分析 （五）細(xì)胞分選器 二、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)第19頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀根據(jù)功能不同可分為臨床型和科研型。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學(xué)易掌握?？蒲行图扔蟹治龉δ苡钟蟹诌x功能，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來。第20頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞

9、儀的分類和基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同又可分為一般流式細(xì)胞儀和狹縫掃描流式細(xì)胞儀。前者的光斑直徑大于被檢細(xì)胞體積，只能提供細(xì)胞內(nèi)某種生物化學(xué)成分的參數(shù)。狹縫掃描流式細(xì)胞儀被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，可計算出細(xì)胞直徑大小、核直徑大小、核漿比例等一系列的形態(tài)學(xué)信息的定量資料。 第21頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類與結(jié)構(gòu) 狹縫掃描流式細(xì)胞儀 被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，細(xì)胞通過光束時各部分被依次掃描。第22頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)二、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)

10、（一）流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔，供細(xì)胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，流動室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。 第23頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu) 由右圖可知，空氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統(tǒng)運行中流速是不變的。 第24頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu) 由于激光焦

11、點處能量分布為正態(tài)分布（見圖），中心處能量最高。因此，當(dāng)樣本速率選擇高速時，處在樣本流不同位置的細(xì)胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發(fā)出的熒光強度也不相同。 第25頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（二）激光光源與光束成形系統(tǒng) 激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照。由于細(xì)胞的快速流動，每個細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1s左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強度。 第26頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式

12、細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（三）光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。濾光片主要分為：1.長通濾光片 長通濾光片使特定波長以 上的光通過。2.短通濾光片 特定波長以下的光通過。3.帶通濾光片 帶通濾光片允許一定波長 范圍內(nèi)的光通過第27頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號檢測與分析 當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射區(qū)時，細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長的熒光信號。這些信號以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號。第28頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的

13、分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號檢測與分析 1.散射光信號 散射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1）前向角散射 前向角散射與被測細(xì)胞的大小有關(guān)（2）側(cè)向角散射 側(cè)向散射光可提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。第29頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號檢測與分析 2.熒光信號 當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒

14、光信號的檢測和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。第30頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號檢測與分析2.熒光信號 （1）熒光信號線性測量和對數(shù)測量線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。在細(xì)胞膜表面抗原等的熒光檢測時通常使用對數(shù)放大器。第31頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號檢測與分析2.熒光信號 （2）熒光信號的面積和寬度熒光信號的面積是采用對熒光光通量進 行積分測量，一般對DNA倍體測量時采

15、用 面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光 脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。熒光信號的寬度常用來區(qū)分雙連體細(xì)胞。第32頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號檢測與分析2.熒光信號 （3）光譜重疊的校正 當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長的熒光時，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。第33頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu) 從右圖中可以看出，陰影為探

16、測器檢測光譜的范圍，F(xiàn)ITC探測器會探測到少量的PE光譜，而PE探測器則檢測到較多的FITC光譜。 第34頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu) 圖中點A通過透鏡f成像在A處，而點B通過透鏡f成像在B處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號，從而確保了A點光源進不了B點處，B點光源也進不了A點處。 第35頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（五）細(xì)胞分選器1小水滴的形成壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。 噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當(dāng)噴嘴直徑為50

17、m時，信號頻率為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個水滴。若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個，則平均每40個水滴中只有一個水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。 第36頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（五）細(xì)胞分選器2邏輯電路 為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過測量區(qū)時判斷出哪個細(xì)胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個邏輯信號，此信號驅(qū)動充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。第37頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（五）細(xì)胞分選器3水滴的充電與偏轉(zhuǎn) 當(dāng)水滴從流束上將要斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶

18、有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負(fù)電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。 第38頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第二節(jié) 流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（六）FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析 目前FCM數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表排隊(List Mode)方式。目前FCM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光標(biāo)記物參數(shù)數(shù)量在逐漸增多。采用List Mode方式可大量節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。第39頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第三節(jié) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo) 一、熒光測量靈敏度 二、儀器的分辨率 三、前向角散

19、射光檢測靈敏度 四、FCM分析速度 五、FCM分選指標(biāo)第40頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第三節(jié) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)一、熒光測量靈敏度 靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標(biāo)。一般以能檢測到單個微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測小于100個熒光分子的指標(biāo)。第41頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第三節(jié) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)二、儀器的分辨率 分辨率是衡量儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV(Coefficient of Variation)值表示：(是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，是分布的平均值)第

20、42頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第三節(jié) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)三、前向角散射光檢測靈敏度 前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.20.5左右。第43頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第三節(jié) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)四、FCM分析速度 分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。當(dāng)細(xì)胞流過光束的速度超過FCM儀器響應(yīng)速度時，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號就會丟失，這段時間稱為儀器的死時間。 死時間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到30006000個/秒左右。大型機已達(dá)到每秒幾萬個細(xì)胞。第44頁，共74頁，2022

21、年，5月20日，11點21分，星期四第三節(jié) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)五、FCM分選指標(biāo) 分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。 分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個數(shù)。 分選純度指要分選的目的細(xì)胞占分選出 細(xì)胞的百分比。 分選收獲率指被分出的細(xì)胞與原來溶液 中該細(xì)胞的百分比。第45頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 流式細(xì)胞分析儀器是一項集多學(xué)科知識綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對儀器各方面性能指標(biāo)有嚴(yán)格的要求以外，在實驗設(shè)計與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗。 一、檢測樣品制備的重要性 二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色 三、FC

22、M操作技術(shù)的質(zhì)量控制第46頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 一、檢測樣品制備的重要性 因為流式細(xì)胞儀測量的是每個細(xì)胞所產(chǎn)生的散射光和熒光信號，如果兩個或多個細(xì)胞間粘連重疊或細(xì)胞碎片過多，都會影響信號的收集及所收集信號的真實性，所以制備單細(xì)胞懸液是進行流式細(xì)胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。第47頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色 散射光信號是激光照在細(xì)胞上所產(chǎn)生的前向光和側(cè)向光信號。熒光信號來自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過激光束激發(fā)后所

23、產(chǎn)生的。因此，被分析細(xì)胞在制備成單細(xì)胞懸液后，經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機進行檢測。第48頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 三、流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制 在臨床檢測中，應(yīng)對各個工作環(huán)節(jié)和儀器性能進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作，以保證各項檢測數(shù)據(jù)和指標(biāo)的可靠性。 1光路與流路校正 2PMT校準(zhǔn) 3絕對計數(shù)的校準(zhǔn)第49頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 1光路與流路校正 主要目的在于確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值。在流路校正物中

24、，有標(biāo)準(zhǔn)大小的熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)特性和化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。 第50頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 2PMT校準(zhǔn) 流式細(xì)胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時間的增加，其放大功率會有所改變，對樣品檢測的靈敏度會產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進行PMT校準(zhǔn)，必要時進行電壓補償。第51頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第四節(jié) 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 3絕對計數(shù)的校準(zhǔn) 為保證儀器在計數(shù)時的準(zhǔn)確性，儀器應(yīng)采用絕對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品建立絕對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的，如以計算1000個細(xì)胞為1m

25、l，作為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。在樣本測定時，以此為標(biāo)準(zhǔn)進行絕對計數(shù)，從而獲得絕對計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。第52頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除 一、儀器的維護1.激光電源的波動范圍應(yīng)小于10%。2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。3.室溫在1824，相對濕度小于85%。4.安裝單獨的可靠的地線。5.儀器操作必須有經(jīng)過培訓(xùn)的人員操作。6.樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。第53頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除故障信息 引起故障的原因 解決方法 清洗液高度錯誤 清洗液少了 加清洗液 清洗液高

26、度警示 清洗液傳感器失靈 與公司聯(lián)系 數(shù)據(jù)處理速率錯誤 數(shù)據(jù)太大，難以處理 稀釋樣品 文件名錯誤 輸入的文件名與系統(tǒng)沖突 輸入另一個文件名 二、常見故障及排除第54頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除故障信息 引起故障的原因 解決方法 存取數(shù)據(jù)時發(fā)生錯誤 流式細(xì)胞儀不能存取數(shù)據(jù) 關(guān)開計算機重試 程序錯誤 軟件不能執(zhí)行該程序 選擇主菜單上的重建項 程序號太大 程序號不能大于32 取消一些程序，再輸入相應(yīng)號碼 沒有激光束 激光器關(guān)閉 檢查電源，開激光器 二、常見故障及排除第55頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第五節(jié)

27、 FCM的維護及常見故障的排除故障信息 引起故障的原因 解決方法 激光器開啟錯誤 激光器門打開 關(guān)激光器門 參數(shù)太多 選擇的參數(shù)應(yīng)小于8個 取消某些參數(shù)，重新選擇 參數(shù)不存在 程序中無此參數(shù) 重新建立程序 二、常見故障及排除第56頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除故障信息 引起故障的原因 解決方法 樣品壓力錯誤 因為樣品管壞了，樣品不能被壓入流動室 換一個樣品管 建立樣品壓力錯誤 流式細(xì)胞儀連接錯誤 檢查連接，開關(guān)機重試 鞘液高度錯誤 鞘液太少 補充鞘液 二、常見故障及排除第57頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期

28、四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用 六、FCM對自身免疫性疾病HLA抗原的分析 二、流式細(xì)胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用 三、流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用 四、流式細(xì)胞儀在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用 五、流式細(xì)胞儀在AIDS病檢測中的分析 七、流式細(xì)胞儀在藥物學(xué)方面的應(yīng)用 一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用第58頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用 流式細(xì)胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研究及其臨床實踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié)合應(yīng)用，在淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫檢測、研究細(xì)

29、胞周期等方面都起著相當(dāng)重要的作用。第59頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用二、流式細(xì)胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用 血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性疾病，惡性血液病約占其總數(shù)一半以上。FCM在血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用廣泛。 第60頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用三、流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用 細(xì)胞生物學(xué)研究中，應(yīng)用最頻繁也最普通的是細(xì)胞周期分析，研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系，包括細(xì)胞周期各時

30、相的百分比和細(xì)胞周期動力學(xué)參數(shù)的測定等內(nèi)容。對同一細(xì)胞的參數(shù)測定技術(shù)則導(dǎo)致了對細(xì)胞周期的一些新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。 第61頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用四、流式細(xì)胞儀在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用 近年來熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及熒光探針標(biāo)記的單克隆抗體，為流式細(xì)胞技術(shù)研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤學(xué)的研究水平，并為流式細(xì)胞技術(shù)在腫瘤學(xué)的研究中開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。 第62頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用五、流式細(xì)胞儀在AIDS病檢測中的分析

31、流式細(xì)胞術(shù)用于AIDS免疫功能的檢測是最重要的檢測手段，采用三參數(shù)熒光標(biāo)記計數(shù)可對T淋巴細(xì)胞及亞群進行分析，并通過動態(tài)監(jiān)測T細(xì)胞亞群可以對HIV感染者或AIDS發(fā)病者進行區(qū)別。 第63頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用六、FCM對自身免疫性疾病HLA抗原的分析 利用FCM可以進行HLA-B27HLA-B7雙標(biāo)記抗體檢測HLA-B27陽性細(xì)胞，同時又可排出交叉反應(yīng)。通常5897的強直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而正常人僅27可檢出這種抗原。FCM檢測HLA-B27快速、特異、敏感，為強制性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助。第64頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四第六節(jié) 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用七、流式細(xì)胞儀在藥物學(xué)方面的應(yīng)用 流式細(xì)胞儀在檢測藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥物的作用機制方面應(yīng)用廣泛。亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤細(xì)胞的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等進行觀察。第65頁，共74頁，2022年，5月20日，11點21分，星期四 本章小結(jié) 本章簡要介紹了流式細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞儀的基本概念。 論述了流式細(xì)胞儀的基本原理、