1、 3/3MSC無血清培養(yǎng)基說明書 http:/./doc/d89e5ad776a20029bd642d21.html NutriStem? MSC XF Medium 間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 使用說明1. 培養(yǎng)基組分 產(chǎn)品名稱 NutriStem? MSC XF Basal Medium 間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 NutriStem? MSC XF Supplement 間充質(zhì)干細(xì)胞無血清營(yíng)養(yǎng)添加物 NutriStem? MSC XF Basal Medium 間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 NutriStem? MSC XF Supplement 間充質(zhì)干細(xì)胞無血清營(yíng)養(yǎng)添加物 注意: 作

2、為完全的，即用型的培養(yǎng)基，不需要額外的添加物。兩種組分不單獨(dú)銷售。 2. 產(chǎn)品描述 NutriStem? MSC XF Medium是無血清、不含異源動(dòng)物成分(Xeno-free) 的人類間充質(zhì)干細(xì) 胞培養(yǎng)基，可促進(jìn)多種來源的人類間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，如骨髓（BM-hMSC）、脂肪組織 （AT-hMSC）、臍帶（UCM-hMSC）。NutriStem? MSC XF Medium可促進(jìn)人類間充質(zhì)干 細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)，同時(shí)還能保持多向分化潛能。NutriStem? MSC XF Medium和MSC間充質(zhì) 干細(xì)胞促貼壁試劑（貨號(hào): 05-752-1）共同使用，細(xì)胞貼壁及增殖效果更好。 3. 特點(diǎn) ?

3、 ? ? ? ? ? 無血清、不含異源動(dòng)物成分：所有成分都是明確的，且同種來源（人），包括蛋白質(zhì)； 不含抗生素； 能夠培養(yǎng)不同來源的人類間充質(zhì)干細(xì)胞； 維持人類間間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)，保留類纖維原細(xì)胞形態(tài)； 極低的背景分化率； 維持間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新及多向分化潛能，可分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞。 貨號(hào) 05-200-1A 05-201-1U 05-200-1B 05-201-1-06 規(guī)格 500 ml 3 ml 100 ml 0.6 ml 儲(chǔ)存條件 4C -20C 4C -20C4. hMSCs對(duì)NutriStem? MSC XF Medium的適應(yīng)性 若之前使用血清培養(yǎng)法，轉(zhuǎn)換

4、至NutriStem? MSC XF Medium間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)，可 能會(huì)面臨細(xì)胞適應(yīng)的問題，需要逐步適應(yīng)，并優(yōu)化培養(yǎng)方案，建議從原代開始使用。 注意：如同任何培養(yǎng)體系的轉(zhuǎn)換，在新的培養(yǎng)體系下細(xì)胞會(huì)損失一部分并需要一定過程適應(yīng)。Biological IndustriesServes Life SciencesPage 1 of 5 http:/./doc/d89e5ad776a20029bd642d21.html 5. 注意事項(xiàng)和免責(zé)聲明 5.1 如果觀察培養(yǎng)基中有可見的沉淀物，不能再使用 5.2 超過標(biāo)簽上的截止使用日期，不得再使用 5.3 所有組分均應(yīng)避光保存 6. 完全即用型培養(yǎng)

5、基的準(zhǔn)備 ? ? 凍存的NutriStem? MSC XF Supplement間充質(zhì)干細(xì)胞無血清營(yíng)養(yǎng)添加物需要在室溫或 2-8C解凍，避免重復(fù)凍融。 完全的NutriStem? MSC XF Medium：將0.6ml的NutriStem?間充質(zhì)干細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)添加物 加進(jìn)100ml的NutriStem?間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（同樣的，將3ml的NutriStem?間充質(zhì) 干細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)添加物加到500ml的NutriStem?間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中），2-8C避光保存， 混合完全的NutriStem? MSC XF Medium在2-8C直到14天都是穩(wěn)定的。 7. MSC貼壁試劑（貨號(hào): 05

6、-752-1）的包被培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備工作 7.1 使用無菌的DPBS溶液（貨號(hào): 02-023-1，不含Ca2+ and Mg2+），將MSC促貼壁試劑稀釋 100倍，用移液管輕輕攪拌混合； 7.2 用稀釋過的MSC貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿； 7.3 使用合適的量以涂層培養(yǎng)孔或板，使用量參照表1； 7.4 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，用保鮮膜包裹涂層的培養(yǎng)皿，然后在2-8C孵育過夜； 7.5 或者在CO2培養(yǎng)箱（36-38C）至少孵育30分鐘； 7.6 接種前，用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)器皿。 表 1 涂層過程中貼壁試劑建議使用量 培養(yǎng)器皿 96 孔板 24 孔板 12 孔板 6 孔板 T25 瓶 注意： 1. 長(zhǎng)時(shí)間

7、用MSC貼壁試劑孵育(至72hr)不會(huì)降低細(xì)胞貼壁和擴(kuò)散性能。 2. 涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2-8C儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。 表面積 cm2/孔或瓶 0.3 1.9 3.8 9.4 25 稀釋 100 倍后的 MSC 貼壁試 劑/孔或瓶 0.1 ml 0.40 ml 0.8 ml 2 ml 5.5 mlBiological IndustriesServes Life SciencesPage 2 of 5 http:/./doc/d89e5ad776a20029bd642d21.html 8. 培養(yǎng)hMSCs 8.1 復(fù)蘇凍存的hMSCs 8.1.1 取5-10ml NutriStem? M

8、SC XF Medium完全培養(yǎng)基，放入50ml的圓錐管中，37C水 浴槽預(yù)熱； 8.1.2 將一管凍存的hMSCs直接放在37C水浴槽快速解凍，并輕微攪拌； 8.1.3 慢慢將細(xì)胞滴加到預(yù)熱的培養(yǎng)基中； 8.1.4 常溫下，細(xì)胞在300-400 xg離心4-5分鐘； 8.1.5 除去上清，然后用0.5-1ml的完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞； 8.1.6 進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)（如:臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)或XTT）； 8.1.7 加一定量的NutriStem? MSC XF Medium完全培養(yǎng)基； 8.1.8 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到用MSC貼壁試劑包被過的培養(yǎng)皿中，接種密度需要計(jì)算（見表2）； 8.1.9 CO2培養(yǎng)箱孵育

9、(36-38C) 注意： 不建議直接離心解凍復(fù)蘇之后的hMSCs。 在這種情況下， 最好跳過步驟4和5， 直接將解凍復(fù)蘇的細(xì)胞加到MSC貼壁溶液涂層的培養(yǎng)皿里， 另外加一定量的NutriStem? MSC XF Medium完全培養(yǎng)基。 8.2 接種hMSCs NutriStem? MSC XF Medium適用于多種來源的hMSCs優(yōu)化增殖。 MSC來源的多樣性和捐贈(zèng)者的不同會(huì)影響MSC增殖速率。為優(yōu)化hMSCs在NutriStem? MSC XF Medium的增殖，建議接種濃度為5000-6000 cell/cm2（表2），然后每2-3天用新鮮的完 全的NutriStem? MSC XF

10、 Medium喂養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)達(dá)到80%融合時(shí)(confluence -即細(xì)胞聚集生 長(zhǎng)面積達(dá)到80%的培養(yǎng)皿面積)，進(jìn)行傳代。 注意： 下面的培養(yǎng)方案是基于使用間充質(zhì)干細(xì)胞消化分離溶液(植物酵素)（貨號(hào)：03-075-1）。另外， 也可以使用其他hMSC消化分離試劑，如間充質(zhì)干細(xì)胞消化分離溶液(非酶法)（貨號(hào)： 03-077-1）。在這種情況下，請(qǐng)按照相應(yīng)的使用說明書進(jìn)行操作。 接種說明書 8.2.1 開始前，將 MSC 消化分離試劑（貨號(hào)：03-075-1）預(yù)熱到室溫； 8.2.2 移去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用不含 Ca, Mg 的 DPBS 浸洗一次； 8.2.3 將 1-3ml 的 MSC 消化

11、分離試劑加入到 T25 培養(yǎng)瓶中（分離試劑加樣量取決于培養(yǎng)面積 大小，以浸沒細(xì)胞為宜）；Biological IndustriesServes Life SciencesPage 3 of 5 http:/./doc/d89e5ad776a20029bd642d21.html 注意事項(xiàng)：細(xì)胞融合率愈高或傳代次數(shù)愈多，分離試劑用量也需相應(yīng)增加。 8.2.4 在室溫下孵育 2-10 分鐘，在顯微鏡下確定細(xì)胞分離/脫壁（孵育 37C 不會(huì)加速分離）。 通常在 2-5 分鐘內(nèi)細(xì)胞分離，輕敲培養(yǎng)瓶/或用槍頭輕微吹打，可使細(xì)胞徹底分離； 8.2.5 分離后，在 5-10ml 的 DPBS 或用預(yù)熱的 Nu

12、triStem? MSC XF Medium 中懸浮細(xì)胞 將 懸浮的細(xì)胞收集到 15ml 的管子中，重新清洗培養(yǎng)瓶可以得到全部的細(xì)胞； 8.2.6 在室溫下，以 300-400 xg 離心細(xì)胞 4-5 分鐘，小心地去掉上清液； 8.2.7 用少量預(yù)熱的 NutriStem? MSC XF Medium 重新懸浮細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； 8.2.8 重新接種細(xì)胞到預(yù)先涂層的培養(yǎng)板中，按照表 2，計(jì)算接種密度和需要培養(yǎng)基的量； 8.2.9 在 CO2 培養(yǎng)箱中孵育； 8.2.10 每 2-3 天，用新鮮的 NutriStem? MSC XF Medium 重新喂養(yǎng)細(xì)胞。 表 2 建議接種密度（大約

13、5000-6000 個(gè)細(xì)胞/cm2） 培養(yǎng)容器 12-well plate 6-well plate T25-flask 8.3 hMSCs 低溫貯藏 8.3.1 用低于室溫， 2-8以下的 MSC 凍存液 （貨號(hào)： 05-712-1， 建議使用 0.5-1 x106 細(xì)胞/ml， 1ml/管）快速懸浮 hMSC 團(tuán)； 8.3.2 快速將凍存管命名并安放在合適的凍存容器中； 8.3.3 將凍存管轉(zhuǎn)移到液態(tài)罐中。 9. 質(zhì)量控制 為保證 NutriStem? MSC XF Medium 的質(zhì)量，每個(gè)批號(hào)的培養(yǎng)基均通過 MSC 生長(zhǎng)曲線試驗(yàn) 并能維持和擴(kuò)增無分化的 hMSCs。附加試驗(yàn)：PH，滲透

14、壓，內(nèi)毒素及無菌試驗(yàn)。 10. 相關(guān)產(chǎn)品 產(chǎn)品名稱 MSC Attachment Solution 間充質(zhì)干細(xì)胞促貼壁試劑 MSC Freezing Solution 無血清間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液 MSC Dissociation Solution 間充質(zhì)干細(xì)胞分離溶液(植物酵素) Non-Enzymatic MSC Dissociation Solution 間充質(zhì)干細(xì)胞分離溶液(非酶法) 貨號(hào) 05-752-1F/H 05-712-1D/E 03-075-1B/C 03-077-1B/C 規(guī)格 1ml/5ml 10ml/50ml 100ml/20ml 100ml/20ml 儲(chǔ)存條件 2-8 2

15、-8 -20 2-8 表面積cm2 3.8 9.4 25 培養(yǎng)基用量 1ml/well 2ml/well 5ml/T-25 建議接種密度 1.8-2.3 x 104cells / well 4.5-5.5 x 104cells / well 12-15 x 104cells / T-25Biological IndustriesServes Life SciencesPage 4 of 5 http:/./doc/d89e5ad776a20029bd642d21.html Dulbeccos Phosphate Buffered Saline, w/o Calcium and Magnesium DPBS（無 Ca & Mg） Nutristem hESC XF with HSA 胚胎干細(xì)胞專用無血清完全培養(yǎng)基（含人血清 白蛋