1、生物技術(shù)(biotechnology)其組分)的特性和功能,設(shè)計(jì)構(gòu)建具有預(yù)期性狀的物種或品系,并與工程相結(jié)合,利用這樣的物種(或品系)進(jìn)展加工生產(chǎn),為社會(huì)供給商品和效勞的一個(gè)綜合性的技術(shù)體系.*第一代生物技術(shù) *其次代生物技術(shù) *海洋生物技術(shù)傳統(tǒng)生物技術(shù)釀造技術(shù)微生物活酵母乙醇發(fā)酵死酵母糖發(fā)酵成乙醇酶近代生物技術(shù)微生物發(fā)酵技術(shù)青霉素醫(yī)用氨基酸鏈霉素酶制劑食用氨基酸金霉素抗生素工業(yè)酶制劑工業(yè)發(fā)酵工業(yè)*現(xiàn)代生物技術(shù)承受現(xiàn)代生物技術(shù)，可以人為地制造一些條件，借助某些微生物、植物或動(dòng)物生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品，稱(chēng)為生物技術(shù)制藥。生物技術(shù)藥物DNA 重組技術(shù)或其他生物技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類(lèi)藥物，稱(chēng)為生物技術(shù)藥

2、物。生物技術(shù)藥物的特性分子構(gòu)造簡(jiǎn)單6免疫原性有種屬特異性7 體內(nèi)半衰期短治療針對(duì)性強(qiáng)，療效高8受體效應(yīng)穩(wěn)定性差9 多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)基因穩(wěn)定性生物技術(shù)制藥的特征高技術(shù)高投入長(zhǎng)周期810年高風(fēng)險(xiǎn)高收益*伯格 美國(guó)生物化學(xué)家 DNA1980*桑格英國(guó)化學(xué)家最早測(cè)定胰島素的氨基酸挨次獲得 1958 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第三章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥質(zhì)，以獲得型生物或特別細(xì)胞產(chǎn)品的一門(mén)綜合性科學(xué)技術(shù)。*細(xì)胞的根本共性細(xì)胞外表都有細(xì)胞膜磷脂雙分子層與蛋白質(zhì)細(xì)胞都含有兩種核酸DNA 與 RNA細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的機(jī)器核糖體原核細(xì)胞與真核細(xì)胞根本特征的比較特征原核細(xì)胞真核細(xì)胞細(xì)胞膜有多功能性有核膜無(wú)有染色體由一個(gè)環(huán)狀 DN

3、A分子構(gòu)成的 2 個(gè)染色體以上，染色體由線與蛋白質(zhì)結(jié)合核仁無(wú)有線粒體無(wú)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)有高爾基體無(wú)有溶酶體無(wú)有核糖體70S80S細(xì)胞壁主要成分是氨基酸與壁酸動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素與果膠細(xì)胞骨架無(wú)有細(xì)胞增殖分裂方式無(wú)絲分裂直接分裂以有絲分裂間接分裂為主為了適應(yīng)功能需要，細(xì)胞形態(tài)有了相應(yīng)的變化稱(chēng)分化或特化貼附依靠型anchorage-dependent概念 中供給的貼附因子才能在該外表上生長(zhǎng)。形態(tài)成纖維細(xì)胞型細(xì)胞特點(diǎn)23走行。來(lái)源：中胚層組織來(lái)源的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞等。上皮型細(xì)胞特點(diǎn)的上皮狀“膜片組織”。來(lái)源細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管

4、內(nèi)皮細(xì)胞等。游走型細(xì)胞特點(diǎn)：在支持物上分散生長(zhǎng)，一般不連接成片、形成群落；胞質(zhì)常伸出偽足和突起；生長(zhǎng)位置不固定，呈活潑的游走和變形運(yùn)動(dòng)，外形不規(guī)章且不斷變化，當(dāng)細(xì)胞密度增大、連接成片時(shí)，外形類(lèi)似于成纖維細(xì)胞型或上皮細(xì)胞型。來(lái)源：主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。多形型細(xì)胞特點(diǎn)：形態(tài)不規(guī)章，一般分胞體和胞突兩局部，其中胞突為瘦長(zhǎng)形，類(lèi)似絲狀偽足；胞體雖然也略呈現(xiàn)多角形，但沒(méi)有成纖維細(xì)胞那樣不規(guī)章。來(lái)源：最常見(jiàn)的是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。非貼附依靠型anchorage-independent懸浮型細(xì)胞細(xì)胞的生長(zhǎng)不依靠支持物外表，可在培育液

5、中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。形態(tài)：始終為球形圓形。兼性貼附型 CHO L929 小鼠肺纖維瘤細(xì)胞條件下還可以在培育基中呈懸浮狀態(tài)良好的生長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)四周的環(huán)境格外敏感動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培育基的要求高動(dòng)物細(xì)胞的合成途經(jīng)和修飾功能與細(xì)菌不同*接觸抑制現(xiàn)象 正常細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，漸漸集合成片時(shí)，由于細(xì)胞的相互接觸而抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)，即接觸抑制現(xiàn)象( contact inhibition。*密度抑制 細(xì)胞接觸集合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要養(yǎng)分充分，細(xì)胞仍舊密度抑制density inhibition，導(dǎo)致細(xì)

6、胞分裂停頓。*Hayflick正常動(dòng)物細(xì)胞無(wú)論在體內(nèi)生長(zhǎng)或在體外培育，其分裂次數(shù)總存Hayflick細(xì)胞增殖到達(dá)肯定密度后，需要分別出局部細(xì)胞，更換養(yǎng)分液，否則將影響細(xì)胞的連續(xù)生存，這一過(guò)程稱(chēng)細(xì)胞傳代原代培育期概念代培育，即直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過(guò)粉碎、消化，接種培育到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。特點(diǎn)原代培育細(xì)胞呈活潑的移動(dòng)，細(xì)胞分裂不旺盛，并多呈二倍體核型物很好的試驗(yàn)對(duì)象是異質(zhì)的，即各細(xì)胞的遺傳性狀互不一樣，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)來(lái)源雞胚細(xì)胞 腎小管上皮細(xì)胞 淋巴細(xì)胞選并純化出某種具有肯定特征的細(xì)胞株。傳代期概念 原代培育細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中選擇并純化出某種

7、具有肯定特征的細(xì)胞株稱(chēng)做細(xì)胞系cellline。此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。特點(diǎn)體核型的細(xì)胞稱(chēng)二倍體細(xì)胞系diploid cell line具有明顯的貼壁依靠和接觸抑制的特性50組織中獵取無(wú)致瘤性來(lái)源 WI-38MRC-5衰退期細(xì)胞仍舊生存，但增殖很慢或不增殖輪廓增加，最終衰退凋亡轉(zhuǎn)化transformation細(xì)胞系特點(diǎn)核型大多變成異倍體失去正常細(xì)胞貼壁依靠和接觸抑制的特性細(xì)胞倍增時(shí)間較短，獲得了無(wú)限增殖的力量永生性或惡性性質(zhì)來(lái)源自發(fā)轉(zhuǎn)化：嚙齒動(dòng)物直接從動(dòng)物的腫瘤組織中建立的細(xì)胞系體外培育細(xì)胞一代生存期細(xì)胞傳代數(shù)passagenumber從細(xì)胞接種到分別再培育時(shí)的次數(shù)細(xì)胞倍增代數(shù)generation

8、number表示細(xì)胞分裂的次數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)代經(jīng)受的階段游離期懸浮期特點(diǎn)貼壁期游離期懸浮期特點(diǎn)貼壁期埋伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停滯期平頂期動(dòng)物細(xì)胞體外無(wú)菌培育的 6 個(gè)條件器材的清楚和消毒3PH5溫度水質(zhì)4滲透壓動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育的方法 例子懸浮培育suspension culture適用細(xì)胞類(lèi)型：懸浮細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，培育條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，產(chǎn)量高缺點(diǎn)：細(xì)胞密度較低設(shè)備貼壁培育anchorage-dependentculture適用細(xì)胞類(lèi)型：貼壁細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞種類(lèi)廣，較簡(jiǎn)潔承受灌流培育的方式使細(xì)胞到達(dá)高密度。操作比較麻煩，需要適宜的貼附材料和足夠的面積，培育條件不

9、易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。貼壁懸浮培育，或稱(chēng)假懸浮培育微載體培育microcarrier culture*抱負(fù)的微載體特征生物相容性6 良好的光學(xué)透亮性材料無(wú)毒性7 保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷材料惰性8高壓滅菌良好的機(jī)械穩(wěn)定性9 反復(fù)利用，易于清洗粒徑分布均一多孔微載體培育porousmicrocarrier*多孔微載體培育優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞在網(wǎng)狀構(gòu)造的小孔內(nèi)部生長(zhǎng)，可降低血清用量過(guò)程簡(jiǎn)潔，增加細(xì)胞固定化穩(wěn)定性大的比外表積保證細(xì)胞充分的生長(zhǎng)空間細(xì)胞生長(zhǎng)在載體內(nèi)部，能使細(xì)胞免受機(jī)械損微囊化培育*微囊化培育優(yōu)點(diǎn)微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避開(kāi)了剪切力的損害可以獲得較高的細(xì)胞密度當(dāng)把握微囊膜的孔徑后，可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)

10、，從而有利于下游產(chǎn)物的純化器等動(dòng)物細(xì)胞培育的操作方式分批式操作batch操作簡(jiǎn)潔直觀的反響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過(guò)程可直接放大流加式操作fed-batch半連續(xù)式操作semi-continuous培育物的體積逐步增加可進(jìn)展屢次收獲可連續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)式操作continuous 灌流式操作perfusion107109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量度積存較低反響速率簡(jiǎn)潔把握，培育周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高性生物工程上的生物反響器 能，在體外進(jìn)展生化反響的裝置系統(tǒng)，是一種生物功能模擬機(jī)抱負(fù)的動(dòng)物細(xì)胞生物反響器具備的根本條件制造生物反響器所承受的一切材料無(wú)毒性生物反響器的構(gòu)造具有良好的傳質(zhì)

11、、傳熱和混合的性能密封性能良好，可避開(kāi)一切外來(lái)微生物的污染且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一可長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無(wú)死角，以削減細(xì)胞或微生物的沉積拆裝、連接和清潔便利，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作修理第六章得有用物質(zhì)的一門(mén)科學(xué)或技術(shù)。植物組織和器官培育：在無(wú)菌和人工把握條件下培育基、光照、溫度等)，爭(zhēng)辯植物的細(xì)胞、組織和器官以及把握其生長(zhǎng)發(fā)育的技術(shù)。術(shù)。外植體explant：用于植物組織細(xì)胞培育的器官或組織的切段，植物體進(jìn)展組織培育。愈傷組織(callus壁細(xì)胞。繼代培育subculture：愈傷組織在培育基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，養(yǎng)分物枯竭，初級(jí)代謝產(chǎn)物特征：有明顯的分類(lèi)學(xué)區(qū)域界限其合成需在

12、肯定的條件下才能發(fā)生缺乏明確的生理功能是生命的多余成分次級(jí)代謝：特別蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合表達(dá)。植物細(xì)胞的構(gòu)造特征植物細(xì)胞細(xì)胞壁原生質(zhì)體液泡生理活性物質(zhì) 物激素和抗生素等后含物 有機(jī)酸、揮發(fā)油等*植物細(xì)胞培育的特性力差培育過(guò)程生長(zhǎng)速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素細(xì)胞生長(zhǎng)的中期及對(duì)數(shù)期，易分散成團(tuán)塊，懸浮培育較難培育時(shí)需供氧，培育液黏度大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌具有群體效應(yīng)，無(wú)貼壁依靠性及接觸抑制性培育細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低培育過(guò)程具有構(gòu)造與功能全能性*植物激素 是指植物代謝過(guò)程中自身形成的植物生長(zhǎng)調(diào)整劑，在極低濃度時(shí)即脫落酸和乙烯。植物細(xì)胞大規(guī)模培育多承受懸浮

13、培育方式，這主要是其具有以下優(yōu)點(diǎn) ：可以增加培育細(xì)胞與培育液的接觸面，促進(jìn)養(yǎng)分的吸取可帶走培育物產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，避開(kāi)高濃度積聚對(duì)細(xì)胞的損害第四章 抗體制藥抗體技術(shù)進(jìn)展經(jīng)受了三個(gè)階段： 第一代為多克隆抗體；其次代為單克隆抗體； 多克隆抗體PcAbB(polyclonal antibody, PcAb)。單克隆抗體McAbB具有高度均一性。HAT系次黃嘌呤hypoxanti、氨基蝶呤aminopterin和胸腺嘧啶脫氧核苷的細(xì)胞培育基單克隆抗體的制備原理： B 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)細(xì)胞融合B5以及 BB 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞才有可能形成分泌特異性抗體的雜交細(xì)胞。要從這些細(xì)胞中篩選出 BHAT 培

14、育液進(jìn)展選HAThypoxantin、氨基蝶呤aminopterin這三種物質(zhì)的細(xì)胞培育基 。HATDNA它參與嘌呤環(huán)和胸腺嘧啶甲基的生物合成。DNAHATDNADNA。DNAH、胸腺嘧啶脫氧核苷TDNA腺嘧啶核苷激酶TK，假設(shè)缺乏其中一種酶，該補(bǔ)救途徑便不能發(fā)揮作用。未融合的脾細(xì)胞及脾細(xì)胞與脾細(xì)胞的融合細(xì)胞由于正常的淋巴細(xì)胞在體外培育不能長(zhǎng)期存活24 周和增殖，因此不需對(duì)其進(jìn)展特別的選擇和去除B 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞形成的雜交瘤才能在HATHGPRT一、人鼠嵌合抗體Igchimeric HL抗體。二、改形抗體IgCDRIg分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。這種改形抗體 reshaping

15、antibodCDRCDRgraftingantibody只占很小比例，可根本消退免疫原性。三、FabFvFabVH+CH1所組成。其次章 基因工程制藥基因工程技術(shù)誕生：20 世紀(jì) 70 年月 現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)展應(yīng)用 DNA 制造的生物物種，通過(guò)工程化手段為人類(lèi)供給有用產(chǎn)品和服 務(wù)的技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)富集的生理活性蛋白和多肽。供給足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)。開(kāi)發(fā)更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)?；钚晕镔|(zhì)。利用基因工程技術(shù)可獲得型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源?；蚬こ趟幬锷a(chǎn)的根本過(guò)程目的基因的獲得構(gòu)建DNA重組體123 是上游技術(shù)構(gòu)建工程菌工程菌的發(fā)酵外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分別純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)國(guó)內(nèi)外基

16、因工程藥物爭(zhēng)辯進(jìn)展目前研制的基因工程藥物主要包括:免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體;凝血因子；激素，如胰島素、生長(zhǎng)激素、心鈉素；歧化酶等。mRNA選擇表達(dá)目的蛋白質(zhì)豐度高的mRNA 的生物材料。RNA。mRNAT引物發(fā)夾構(gòu)造S 核酸cDNA其次鏈的合成 RNaseH1質(zhì)粒 入噬菌體cDNA克隆、A T克隆酶 定向化學(xué)法核酸探針寡核苷酸探針抗體cDNA 文庫(kù)的鑒定 抗體抗性獲得 抗性失活顯色轉(zhuǎn)染目的 cDNA 克隆的分別和鑒定二、化學(xué)合成法酶切、 測(cè)序閱讀計(jì)算機(jī)關(guān)心分析優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、人工接頭、改進(jìn)、利用局限性：1小分子量的蛋白或多肽核苷酸挨次或氨基酸挨次費(fèi)用較高DNA、RNA、Pr宿主菌的選

17、擇原核細(xì)胞大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等真核細(xì)胞酵母、絲狀真菌、動(dòng)物細(xì)胞等原核細(xì)胞大腸桿菌缺點(diǎn)：胞內(nèi)表達(dá)，提取困難。包含體形式，需復(fù)性。表達(dá)后不存在修飾作用，應(yīng)用受限。AUG簡(jiǎn)潔引起免疫反響。大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素給純化帶來(lái)不便。蛋白酶水解作用破壞產(chǎn)物。枯草芽孢桿菌缺點(diǎn)：蛋白酶水解活性更強(qiáng)。鏈霉菌優(yōu)點(diǎn)：不致病分泌力量強(qiáng)具有糖基化力量缺點(diǎn)：培育條件要求高、遺傳穩(wěn)定性差真核細(xì)胞酵母：無(wú)毒、倍增時(shí)間短、分泌功能、糖基化作用、使之成為抱負(fù)的宿主。絲狀真菌：肽剪切、糖基化。大腸桿菌中的基因表達(dá)載體表達(dá)載體必需具備以下條件：載體能獨(dú)立復(fù)制具有多克隆MCS位點(diǎn)和標(biāo)記基因具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子具有調(diào)整基因具有很強(qiáng)的終

18、止子mRNA基因工程藥物爭(zhēng)辯中常用的表達(dá)載體PBV220 PL、PR rrnB PL、PRrrnBMCSSD CITS857溫控誘導(dǎo)質(zhì)粒較小366kb，便于插入大的外源基因PBG-2:由PBV220 衍生,可以表達(dá)與IgG便于表達(dá)后純化及純化后剪切。PET IPTG異丙基-硫代-D-半乳糖苷NdeINCOIATG，便于外源基因插入表達(dá)。便于純化。2影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱SD 序列的有效性SDATG密碼子的組成偏愛(ài)性產(chǎn)物的穩(wěn)定性大腸桿菌中的基因表達(dá)表達(dá)形式融合蛋白，增加穩(wěn)定性。酵母中的基因表達(dá)1載體酵母附加體質(zhì)粒由大腸桿菌質(zhì)粒，2 mTrpURA3ARS2

19、 mDNA、TrP1、URA3桿菌質(zhì)粒。YCP酵母著絲粒型質(zhì)粒除具有 YRP 元件外，還具有著粒成份。YIP酵母整合型質(zhì)粒含有可與染色體進(jìn)展同源重組的序列酵母表達(dá)型質(zhì)粒分泌型表達(dá)質(zhì)粒帶有把握蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)TATA分泌信號(hào)序列終止序列翻譯后修飾對(duì)宿主影響粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和構(gòu)造不穩(wěn)定。質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的緣由：質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定性：指工程菌分裂時(shí)消滅肯定比列不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。主要與兩個(gè)因素有關(guān)：條件有關(guān)。含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌比生長(zhǎng)速率的差異的大小。質(zhì)粒的構(gòu)造不穩(wěn)定性：提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法選擇適宜的宿主菌選擇適宜的載體選擇壓力分階段把握培育把

20、握培育條件固定化基因工程藥物的分別純化基因工程產(chǎn)品純化前的性質(zhì)：目的產(chǎn)物在體系中含量較低體系中組份簡(jiǎn)單細(xì)胞、代謝物、殘留培育基及無(wú)機(jī)鹽等目的產(chǎn)物穩(wěn)定性差：對(duì) pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、外表活性劑等格外敏感，簡(jiǎn)潔失活、變性。 建立分別純化工藝需了解的各種因素含目的產(chǎn)物的初始物料的特點(diǎn)術(shù)和工藝有直接影響。這些因素包括：菌種類(lèi)型、形式，各種生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類(lèi)、產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)所處的位置，表達(dá)方式胞內(nèi)、胞外、包含體，代謝物種類(lèi)，產(chǎn)物類(lèi)似物、毒素和能降解產(chǎn)物的酶類(lèi)等；原材料和培育基的來(lái)源及質(zhì)量是否穩(wěn)定；生產(chǎn)周期，生產(chǎn)力量，工藝把握條件及方式等；度、鹽的種類(lèi)和濃度、溶解度、pH、粘度、

21、流體力學(xué)性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)等。物料中雜質(zhì)種類(lèi)和性質(zhì)對(duì)分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性(對(duì)熱、pH、鹽、有機(jī)溶劑等)、溶解度、安排系數(shù)、揮發(fā)性及吸附性能等。目的產(chǎn)物的特性目的產(chǎn)物特性主要有產(chǎn)物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性。熱、冷凍、pH、鹽、有機(jī)溶劑和金屬離子等)、疏水性、集中性、集中系數(shù)、安排系數(shù)、吸附性能、生物活性、親和性、配基種類(lèi)、外表活性等。產(chǎn)品質(zhì)量要求用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。分別純化的根本過(guò)程純化直至得到純品、成品加工等步驟。分別純化的技術(shù)特點(diǎn)：條件溫存選擇性好收率要高細(xì)胞的裂開(kāi)方法細(xì)胞收集離心膜過(guò)濾細(xì)胞裂開(kāi)物理裂開(kāi)法：高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲裂開(kāi)法、高壓擠壓法化學(xué)

22、裂開(kāi)法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法生物裂開(kāi)法：酶溶法溶菌酶、甘露糖酶 、殼多糖酶等固液分別分別細(xì)胞碎片常用的方法有：離心沉淀：高速離心、超速離心膜過(guò)濾：微濾、超濾和反滲透雙水相萃?。壕垡叶?葡聚糖聚乙二醇-無(wú)機(jī)鹽重組蛋白質(zhì)的分別純化分別純化主要依靠色譜分別方法。高效液相色譜等。是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流淌相中的組分別子與交換劑上的平衡離子進(jìn)展可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差異而進(jìn)展分別的一種層析方法。pH、兩性分子、側(cè)鏈、 NH3COO疏水層析：蛋白質(zhì)組分進(jìn)展分別的層析方法。疏水層析最常用填料是多聚糖如瓊脂糖及硅膠。利用氨基酸側(cè)鏈的疏水鍵。親和層析：是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間格外特異的生物

23、親和力進(jìn)展吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，轉(zhuǎn)變條件可以使這種結(jié)合解除。又稱(chēng)為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)展分別的液相層析方法。大分子先從色譜柱中流出六、非蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)的去除DNADNApH 4. 0PI6. 0 DNA吸附上去。利用親和層析吸附蛋白質(zhì)，而 DNA 不被吸附，也可分別。疏水層析對(duì)分別也有效，在上柱時(shí)需要高鹽濃度，使DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物離DNA熱原質(zhì)的去除整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)展，防止產(chǎn)生熱原質(zhì)。28下進(jìn)行操作，洗脫液需先經(jīng)無(wú)菌處理，流出的蛋白質(zhì)溶液也應(yīng)無(wú)菌處理，即通過(guò) 0. 2m 微濾膜，并在 28下保存。病毒的去除成

24、品中必需檢查是否含有病毒。病毒主要來(lái)源于宿主細(xì)胞。經(jīng)過(guò)色譜分別， 一選擇分別純化方法的依據(jù)依據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇依據(jù)分別單元之間的連接選擇依據(jù)分別純化工藝的要求來(lái)選擇要具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。要盡可能削減組成工藝的步驟。適應(yīng)。量。工藝時(shí)間要盡可能短。工藝和技術(shù)必需高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備要求低，能耗低。變性蛋白的復(fù)性包涵體形成的緣由包含體形成的緣由主要是高水平表達(dá)的結(jié)果。會(huì)導(dǎo)致包含體的形成。因子，如折疊酶和分子伴侶等，也導(dǎo)致包含體的形成。包含體雖然由無(wú)活性的蛋白組成，但包含體形成對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)供給了幾個(gè) 優(yōu)勢(shì)：包含體具有高密度，易于分別純化；蛋白的降解；包涵體的分別和溶解包含體的分別1

25、對(duì)培育收集的重組菌進(jìn)展裂開(kāi)高壓勻漿、超聲波裂開(kāi)等，為了提高裂開(kāi)2離心除去裂開(kāi)上清液，沉淀局部用含有低濃度的變性劑如脲和鹽酸孤、去垢劑如 Triton X-100、脫氧膽酸鈉等化合心法。包含體的溶解SDS、巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇及半胱氨酸。溫度一般選擇在 30以促EDTA包涵體蛋白復(fù)性方法有效的、抱負(fù)的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：活性蛋白質(zhì)的回收率高。正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分別。折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。折疊復(fù)性方法易于放大。復(fù)性過(guò)程耗時(shí)較少。 基因工程藥物的質(zhì)量把握醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點(diǎn)1床試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)范圍須依據(jù)不同狀況作不同規(guī)定。產(chǎn)

26、品本身的構(gòu)造視其特點(diǎn)作藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)爭(zhēng)辯。對(duì)基因修飾產(chǎn)品，要作一般毒性、長(zhǎng)期毒性以及致突變、致癌變和致畸變等遺傳毒理爭(zhēng)辯。嚴(yán)格把握條件量，確保符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格、安全有效。生物材料的質(zhì)量把握DNA量把握主要是對(duì)目的基因、表達(dá)載體以及宿主細(xì)胞的檢查。1.目的基因修改的密碼子、被切除的肽段及拼接的方法；2.表達(dá)載體應(yīng)供給表達(dá)載體的名稱(chēng)、構(gòu)造、遺傳特性及其各組成局部 (如復(fù)制子、啟動(dòng)子)的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物等。3.宿主細(xì)胞主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平。培育過(guò)程的質(zhì)量把握重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排解外源微生物污染。生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)DNA微生物污染；供給培育生產(chǎn)濃度與

27、產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)穩(wěn)定性確定最高允許傳種代數(shù)。培育過(guò)程征；依宿主細(xì)胞/載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培育時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。培育周期完畢時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。純化過(guò)程的質(zhì)量把握DNA、糖類(lèi)、剩余宿主蛋白質(zhì)、純化過(guò)程帶入的有害化學(xué)物質(zhì)及熱原質(zhì)，或者將這類(lèi)雜質(zhì)都把握在規(guī)定限度以下。慮到屢次使用的積蓄作用。Protein AProtein A質(zhì)應(yīng)加以去除和把握。Protein AProtein A質(zhì)應(yīng)加以去除和把握。目的產(chǎn)品的質(zhì)量把握等多門(mén)學(xué)科的理論與技術(shù)，才能切實(shí)保證基因工程藥品的安全有效。 1生物活性測(cè)定細(xì)胞培育計(jì)數(shù)法、3HTdR比活性可以間接地反響這一狀況。2理化性質(zhì)鑒別非特異性鑒別依據(jù)復(fù)原型電泳的遷移率和高效液相色譜的保存時(shí)間和峰型來(lái)進(jìn)展分析。特異性鑒別區(qū)帶時(shí)則應(yīng)當(dāng)用免疫印跡進(jìn)展鑒定。相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定SDS-SD