1、朊病毒及其檢測小組成員：石勇軍 費 鵬 閆 凱 王培培 嚴 姍 辛儒岱關亞飛 崔金紅 CONTENTS一、前言二、PrPC與PrPSC三、PrPC的功能四、朊病毒的致病機理五、朊病毒的檢測六、問題與展望一、前言1引言 傳染性海綿狀腦病(transmissible spongi-form encephalopathy, TSE)是一類致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。在哺乳動物中常見瘋牛病、羊瘙癢癥、貓海綿狀腦病以及傳染性水貂腦軟化病等；在人身上則發(fā)現(xiàn)了庫魯病、致死性家族失眠癥、克-雅氏病以及格斯特曼綜合癥等?；疾〉娜撕蛣游?，大腦皮層的神經(jīng)元細胞會發(fā)生進行性空泡化, 星形膠質細胞不斷增生, 造成灰質變

2、薄而白質相對明顯,最后變成海綿狀態(tài)。（左）病羊神經(jīng)組織的海綿狀損傷。（右）病人大腦組織切片，海綿狀病變及周圍的沉淀斑2朊病毒的發(fā)現(xiàn)200多年前英國的牧人就注意到羊的一種致死性疾病。 20世紀初M. fadyian 提出該病是由寄生蟲引起的。1936年Cuille 等發(fā)現(xiàn)瘙癢因子有傳染性，用濾膜過濾后仍具有傳染性，而提出該因子是一種病毒。1966年Gajdusek 證實了CJD 的傳染性，并根Scrapie 、Kuru、CJD3種疾病的共同特征提出了傳染性海綿狀腦病(TSE) 這一概念。1882美國生物化學家Prusiner證明并提出羊瘙癢病的病原體是一種不含核酸和脂類的疏水性糖蛋白，稱為蛋白質

3、侵染因子(proteinaceous infectious particle，簡稱prion)。3朊病毒引起的人類疾病4朊病毒引起的人類疾病 疾病癥狀腦組織變化羊瘙癢癥患病羊傾向蹭掉他們的毛，其他癥狀諸如：行走困難、行動喪失協(xié)調性。牛海綿狀腦病(BSE)多數(shù)病牛行為反常、煩躁不安、對聲音和觸摸過敏，兩耳對稱活動困難，心搏緩慢，呼吸緩慢，體重下降，極度消瘦。病牛腦灰質部分形成海綿狀空泡，腦干灰質兩側呈對稱病變，神經(jīng)纖維網(wǎng)有卵形和球形空洞，神經(jīng)細胞腫脹層氣球狀?？蓚魅拘怎跄X病(TME)初期一般表現(xiàn)為食欲不振、日漸消瘦和衰弱，皮毛變粗，且隨著疾病的發(fā)展，動物將靜進性變得興奮；嚴重時快速轉圈，禁不住咬

4、尾和緊閉下巴；臨死前變得嗜睡。尸檢可見脫水和消瘦，腦皮質和皮質下廣泛的海綿狀變性并伴有神經(jīng)膠質星狀細胞增生。慢性消瘦病(CWD)慢性消瘦，體重減輕；大多數(shù)表現(xiàn)為逐漸減少與其他動物的接觸，倦怠，面無表情且反復以一定的模式行走；飲水和尿量增多。5疾病來源人類prion病約有15%的患者具有遺傳性，即為家族性疾病，為常染色體顯性遺傳，因編碼PrP的基因突變所致。遺傳性由食用瘋牛病病牛及其他染病動物所致。食源性傳播目前已報道全世界因醫(yī)源性傳染而引起的prion病已達160多例，而且，輸血及血制品是否也能傳播此病，已引起人們的關注。醫(yī)源性感染6致病特點2一旦發(fā)病，呈慢性、進行性發(fā)展，以死亡告終；5患者以

5、癡呆、共濟失調、震顫等為主要臨床表現(xiàn)。4無抗原性，不能誘導產(chǎn)生特異性免疫應答；1潛伏期長，可達數(shù)月至數(shù)年甚至數(shù)十年；3病理學特征是大腦皮質神經(jīng)元空泡變性、死亡、缺失，而星形膠質細胞高度增生，故大腦皮質疏松呈海綿狀：有淀粉樣斑塊形成，HE染色淡紅腦組織中無炎癥反應：無淋巴細胞和炎癥細胞浸潤；二、PrPC與PrPSC結構 轉化理化性質PrPC與PrPSC朊病毒蛋白(Prion Protein)，簡稱為PrP。PrPC是指一般情況下，正常宿主細胞基因編碼產(chǎn)生的朊蛋白，無致病性，是一種糖基磷脂酞肌醇(CPI)修飾膜在糖蛋自。廣泛表達于脊椎動物，它與神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持、淋巴細胞信號轉導、核酸代謝等有關。

6、PrPC當其發(fā)生構象改變后可變成致病性朊病毒(PrPsc)，PrPsc可引起包括瘋牛病在內(nèi)的一系列致死性神經(jīng)性疾病。相對分子質量為2730KD，故又稱作PrP2730。PrPSC1PrPC與PrPSCPrPc PrPSc螺旋折疊 二者是異構體,由同一染色體基因PRNP編碼，其氨基酸序列完全一致,根本差別在于它們構象上的差異，PrPC分子中含42%的螺旋，折疊僅為3 %，而PrPSC的折疊高達43 %，螺旋為30 %。故一般認為，PrPSC是由于PrPC發(fā)生蛋白質錯誤折疊，一些螺旋變構為折疊，三維構象發(fā)生變化而產(chǎn)生的，同時帶來一系列理化性質的變化。2PrPC與PrPSC的結構3PrPC與PrPS

7、C的理化性質4PrPC向PrPSC的轉化（PrPSc的累積）（PrP轉化為PrPSc)(PrP與PrPSc之間反應)（PrPc內(nèi)生）模型一 ：該模型是假定一個單一的PrPSC分子與一個單一的PrPC分子結合并催化其轉化成PrPSC。這兩個PrPSC分子,可以繼續(xù)轉換成PrPC。(伸長)（構象變化)(破碎成多個部分)（感染）模型二：假設PrPSC只是纖維，捆綁PrPC fibril，然后將其轉化成PrPSC，形成更長的纖維，這一現(xiàn)象可在染病毒致病中觀察到。三、PrPC的功能核酸代謝抗氧化參與神經(jīng)系統(tǒng)Cu2+代謝維持神經(jīng)系統(tǒng)功能信號轉導細胞調亡PrPC的功能1維持神經(jīng)系統(tǒng)功能 在所有細胞類型中,以

8、神經(jīng)元表達PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突觸處(終板處也有富集)，這提示PrPC對神經(jīng)系統(tǒng)有特殊的重要性。PrPC除實驗表明，PrPC缺失雖不引起肉眼可見的行為和發(fā)育障礙，但在整體動物水平來看可導致與晝夜節(jié)律有關的行為異常。在神經(jīng)系統(tǒng)水平，PrPC缺失可導致電生理參數(shù)方面的改變。有證據(jù)表明，在出現(xiàn)進行性運動失調癥狀PrPC缺失小鼠中，發(fā)現(xiàn)腦部嚴重萎縮，蒲肯野細胞異常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野細胞過度興奮而導致小鼠死亡。PrPC缺陷鼠還表現(xiàn)出對外源性銅和過氧化氫等應激誘導劑應答方面的改變。在細胞水平，PrPC缺陷鼠的神經(jīng)元在培養(yǎng)時存活能力下降，且對銅和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所導致

9、的氧化損傷和毒性的敏感性增加；星形膠質細胞在攝取谷氨酸方面有異常；小膠質細胞對興奮物質的反應性下降；在突觸形成中有結構改變。由此可見，PrPC可能在一定程度上參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持。2參與神經(jīng)組織的Cu2+代謝 PrPC作為腦組織中膜在銅結合蛋自參與神經(jīng)組織中Cu2+的穩(wěn)態(tài)平衡調節(jié)，當轉變?yōu)镻rPSC就失去結合Cu2+的能力，造成神經(jīng)組織中Cu2+含量異常，導致神經(jīng)細胞損傷。 Cu2+對不同神經(jīng)細胞PrPC的影響也不相同。3抗氧化 PrPC通過與銅原子形成復合物而發(fā)揮抗氧化活性。PrPC借其八肽重復區(qū)最多可結合4個銅原子。結合后形成的復合物具有抗氧化活性，從而保護細胞免受氧化損傷。4參與淋巴細

10、胞信號轉導 PrPC可高水平地在人T、B淋巴細胞、單核細胞及樹突狀細胞中表達，不同細胞中表達PrPC的糖基組成、糖鏈形狀及蛋自酶解的敏感性都有差異。 T細胞的活化伴隨著其表而PrPC的表達上調，且PrPC在記憶T細胞比初始T細胞的表達水平高。5細胞凋亡 在PrP敲除小鼠神經(jīng)元中，多種凋亡相關蛋自顯著增加，線粒體Ca2+含量改變、細胞色素c釋放，都表明PrP參與細胞凋亡調控過程。 體外試驗也顯示PrPC能夠保護人的神經(jīng)元免受Bax誘導的細胞凋亡，而缺失八肽序列或C端帶有突變的PrP均不具有該活性。6核酸代謝 Gabus等根據(jù)小鼠中瘟癢病的感染過程會因鼠自血病病毒（MuLV）的復制而加速，以及人類

11、PrP功能上類似于NCp7，可輔助反轉錄酶合成前病毒DNA等現(xiàn)象，提出PrP可能參與了體內(nèi)核酸代謝過程。四、朊病毒的致病機理致病機理電泳活性染色法阮病毒學說 “yeast prions”學說 1阮病毒學說 PrPC是一種膜蛋白，其C端含有23個氨基酸組糖基磷酸肌醇(GPI)錨受體結合位點，因此可通過糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol phosphohptds)聯(lián)在膜上，定位于細胞膜的穴樣內(nèi)陷類結構域（CLDs），在神經(jīng)元，當膜漿膜上的PrPC變成為PrPSC后，PrPSC脫落并聚集在神經(jīng)元的溶酶體。當達到數(shù)量，就可使神經(jīng)元細胞破裂，形成神經(jīng)組織的空泡化，并使星型膠質細胞增生，2“yeas

12、t prions”學說 3蛋白的氧化反應學說 楊池明提出了瘋牛病蛋白長壽命自由基即為瘋牛病中的亞病毒的理論設想，他認為真正的瘋牛病蛋白亞病毒可能是由蛋白的氧化反應所形成的瘋牛病蛋白自由基。 應用此理論能夠解釋瘋牛病的一些病理現(xiàn)象。五、朊病毒的檢測接種傳遞組織印記法酶聯(lián)免疫吸附法毛細管凝膠電泳朊病毒的檢測取組織標本 10倍連續(xù)稀釋研 磨10個稀釋濃度分別接種小鼠直到死亡或盲傳幾代 出現(xiàn)癥狀殺死，取腦組織檢查 死亡不出現(xiàn)癥狀 觀察飼養(yǎng)24h未死亡正常飼養(yǎng) 補接1動物的接種傳遞實驗取標本甲酚脫毒甲醛固定石蠟包埋 55干燥二甲苯脫蠟 異丙醇水化 空氣干燥蛋白酶K消化 鹽酸胍處理 1. 前處理2. 檢測

13、NC：硝酸纖維素膜 前處理品免疫學檢測取出NC膜5-7m薄片收集在NC上2mm厚切片切片55水浴2組織印記法勻漿離心處理顯色最后酶標儀讀板將腦組織置于8%的Zwittergent 3-12和0.5%十二烷基肌氨酸鈉中 加入特異性一抗加入酶標二抗最后加入底物用膠原酶、DNase I（脫氧核糖核酸酶I），蛋白酶K處理 收集富含PrPsc沉淀，將所得沉淀溶于3-4mol/L硫氰酸胍，包被酶標版 3酶聯(lián)免疫吸附法人工合成的PrPsc特異性肽鏈標記熒光 一定量的特異性抗體、羊腦提取物 標記的肽鏈與抗體結合后，遷移率發(fā)生改變 未與抗體結合的肽鏈，遷移率不變當腦提取物中存在微量的PrPsc時 當腦提取物中不存在微量的PrPsc時 電泳PrPsc與標記肽鏈競爭結合抗體 無競爭存在 結合型肽鏈與游離型肽鏈的比例發(fā)生變化 比例固定不變游離的與結合的肽鏈分離（比例固定）4毛細管凝膠電泳免疫測定法六、展望高級結構致病原因感染性 如何對非結晶型的朊病毒蛋白進行分子