1、工業(yè)微生物代謝控制育種第1頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三工業(yè)微生物代謝控制育種第2頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三代謝控制發(fā)酵大體過(guò)程如下：以生物化學(xué)和遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，研究代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制選擇巧妙的技術(shù)路線，通過(guò)遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過(guò)了微生物正常代謝途徑的突變株從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量合成和累積。 代謝控制發(fā)酵的關(guān)鍵：取決于微生物代謝調(diào)控機(jī)制是否能夠被解除，能否打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。實(shí)現(xiàn)代謝控制目標(biāo)的手段：代謝控制育種和發(fā)酵過(guò)程的代謝控制培養(yǎng)，而代謝控制育種則為主要支柱技術(shù)。第3頁(yè)，共

2、63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三 微生物菌體積累的發(fā)酵產(chǎn)物主要有 酶 代謝產(chǎn)物 （酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、抗生素、維生素、脂肪、多糖等） 這些產(chǎn)物中有些是某種微生物在一定的環(huán)境條件下生成的，如酒精、乳酸等；也有許多產(chǎn)物是生理正常的微生物不能過(guò)量積累的，必須是具有特異生理特征的微生物才能積累。人為地改變微生物的代謝調(diào)控機(jī)制，使有用的中間代謝產(chǎn)物過(guò)量積累，這種發(fā)酵稱(chēng)為代謝控制發(fā)酵。第4頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三 考察工業(yè)微生物發(fā)展史，可以看到經(jīng)典的誘變育種具有一定盲目性，而代謝控制育種將微生物遺傳學(xué)的理論與育種實(shí)

3、踐密切結(jié)合，先研究目的產(chǎn)物的生物合成途徑、遺傳控制及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，然后進(jìn)行定向控制育種。代謝控制發(fā)酵的出現(xiàn)與發(fā)展，與以下幾方面是密不可分的：生物化學(xué)的發(fā)展，確立了代謝圖譜，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了代謝過(guò)程中的各種調(diào)節(jié)機(jī)制；分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，可以人為地在DNA分子水平上改變微生物的代謝，多方面利用微生物的代謝活性；合理控制環(huán)境，采用過(guò)程控制方法，對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行最優(yōu)化控制，使目的產(chǎn)物大量積累。第5頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三第一節(jié) 概 論一、初級(jí)代謝產(chǎn)物和初級(jí)代謝初級(jí)代謝產(chǎn)物微生物產(chǎn)生的對(duì)自身生長(zhǎng)和繁殖必須的物質(zhì)初級(jí)代謝產(chǎn)生這些物質(zhì)的代謝系稱(chēng)為初級(jí)代謝。初級(jí)代謝體系分解代

4、謝體系：包括糖、脂、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的降解，獲取能量素材性生物合成體系：合成某些小分子材料結(jié)構(gòu)性生物合成體系：用小分子合成產(chǎn)物裝配大分子。第6頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三二、次級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝根據(jù)Demain的定義：“次級(jí)代謝產(chǎn)物是對(duì)產(chǎn)生它們的生物體本身不需要的一種產(chǎn)物”。這些物質(zhì)有抗生素、生長(zhǎng)刺激素、生物堿、色素、毒素以及甾體等。通常把以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成次生產(chǎn)物的代謝體系稱(chēng)為次級(jí)代謝。第7頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三三、初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的關(guān)系1.菌體代謝方面 抗生素是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中的一大類(lèi)。微生物的初級(jí)代謝與次級(jí)代謝既

5、有區(qū)別，又有聯(lián)系。 許多抗生素的基本結(jié)構(gòu)是由少數(shù)幾種初級(jí)代謝產(chǎn)物構(gòu)成的，所以次級(jí)代謝產(chǎn)物是以初級(jí)代謝產(chǎn)物為母體衍生出來(lái)的，次級(jí)代謝途徑并不是獨(dú)立的，而是與初級(jí)代謝途徑有密切關(guān)系的。 糖代謝中間體，既可用來(lái)合成初級(jí)代謝產(chǎn)物，又可用來(lái)合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，這種中間體叫做分支(叉)中間體。第8頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三分叉中間體初級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝產(chǎn)物-氨基己二糖丙二酰CoA乙酰CoA賴(lài)氨酸脂肪酸青霉素、頭孢菌素利福霉素族、四環(huán)素族大環(huán)內(nèi)酯族、多烯族抗生素、灰黃霉素、橘霉素、環(huán)己酰亞胺、棒曲霉素莽草酸對(duì)氨基苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸、對(duì)氨基苯甲酸、色氨酸氯霉素綠膿菌素新生霉素第

6、9頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三 次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，至少有一部分取決于與初級(jí)代謝產(chǎn)物無(wú)關(guān)的遺傳物質(zhì)，并和由這類(lèi)遺傳物質(zhì)形成的酶所催化的代謝途徑有關(guān)，它們多數(shù)是特異菌株。從代謝途徑來(lái)看，次級(jí)代謝產(chǎn)物是以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體衍生出來(lái)的，見(jiàn)下圖。第10頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三脂肪酸（nC3、nC2）葡萄糖（C6）丙糖P丙酮酸（C3）（C3）乙酰CoA（C2）檸檬酸（C6）草酰乙酸-酮戊二酸（C5）CO2CO2谷氨酸（C5N）次級(jí)代謝產(chǎn)物戊糖（C5）氨基糖苷類(lèi)抗生素糖苷類(lèi)多糖核苷核苷類(lèi)抗生素絲氨酸（C3N）甘氨酸（C2N）半胱氨酸次級(jí)代謝物丁糖

7、（C4）莽草酸（C7）芳香族氨基酸次級(jí)代謝產(chǎn)物芳香族次級(jí)代謝產(chǎn)物纈氨酸（C5N）生物甲基化次級(jí)代謝產(chǎn)物C1丙氨酸（C3N）甲羥戊酸（C3）焦磷酸異戊酯（C3）CO2萜甾體甾體（6C5）丙二酸（C3）CO2CO2CO2聚酮體次級(jí)代謝產(chǎn)物天冬氨酸（C4N）（nC2）葡萄糖分解代謝的主要途徑初級(jí)代謝的合成過(guò)程圖從碳代謝流看初級(jí)代謝與次級(jí)代謝第11頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三 由初級(jí)代謝產(chǎn)物衍生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑有七種。在這些次級(jí)代謝途徑中所涉及的酶有的是初級(jí)代謝酶，有的是次級(jí)代謝所特有的酶。初級(jí)代謝與次級(jí)代謝都受菌體的代謝調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)控制上是相互影響的，當(dāng)與抗生

8、素合成有關(guān)的初級(jí)代謝途徑受到控制時(shí)，抗生素的生物合成必然受阻。 葡萄糖碳架參入途徑 莽草酸途徑 與核苷有關(guān)的途徑 聚酮糖和聚丙酸途徑 由氨基酸衍生的途徑 甲羥戊酸途徑 其他復(fù)合途徑綜上所述，在代謝途徑、酶系關(guān)系以及調(diào)控上，次級(jí)代謝與初級(jí)代謝都有著密切關(guān)系。因此，在研究次級(jí)代謝時(shí)，必須與初級(jí)代謝聯(lián)系起來(lái)考慮。第12頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三2. 遺傳代謝方面 初級(jí)代謝與次級(jí)代謝同樣都受到核內(nèi)DNA的調(diào)節(jié)控制,而次級(jí)代謝產(chǎn)物還受到與初級(jí)代謝產(chǎn)物合成無(wú)關(guān)的遺傳物質(zhì)的控制,即受核內(nèi)遺傳物質(zhì)(染色體遺傳物質(zhì))和核外遺傳物質(zhì)(質(zhì)粒)的控制.有一部分代謝產(chǎn)物的形成，取決于由質(zhì)粒

9、信息產(chǎn)生的酶所控制的代謝途徑，這類(lèi)物質(zhì)稱(chēng)為質(zhì)粒產(chǎn)物。 由于這類(lèi)物質(zhì)的形成直接或間接受質(zhì)粒遺傳物質(zhì)的控制，因而產(chǎn)生了質(zhì)粒遺傳的觀點(diǎn)。 也有只由染色體DNA控制的抗生素產(chǎn)物。第13頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三次級(jí)代謝產(chǎn)物（質(zhì)粒產(chǎn)物）初級(jí)代謝產(chǎn)物（質(zhì)粒產(chǎn)物）底物（營(yíng)養(yǎng)物） 中間體（質(zhì)粒產(chǎn)物）底物（異常營(yíng)養(yǎng)物）酶、蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)、次級(jí)代謝產(chǎn)物（質(zhì)粒產(chǎn)物）核糖核蛋白體系統(tǒng)mRNAmRNA染色體質(zhì)粒次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成與初級(jí)代謝產(chǎn)物的關(guān)系第14頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三第二節(jié) 初級(jí)代謝的調(diào)節(jié)控制一、酶合成的調(diào)節(jié)通過(guò)調(diào)節(jié)酶合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率，是

10、在基因水平上（原核生物中轉(zhuǎn)錄水平）的代謝調(diào)節(jié)特點(diǎn)：間接緩慢、節(jié)約能量和原料酶合成調(diào)節(jié)誘導(dǎo)酶合成阻遏酶合成 酶合成調(diào)節(jié)的類(lèi)型誘導(dǎo)：當(dāng)環(huán)境中存在誘導(dǎo)物（底物及類(lèi)似物、底物前體）時(shí)，促進(jìn)酶合成，誘導(dǎo)方式有同時(shí)誘導(dǎo)、順序誘導(dǎo) 阻遏：過(guò)量代謝產(chǎn)物阻礙代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的合成，從而控制代謝，減少末端產(chǎn)物的合成第15頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三 酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制乳糖操縱子的調(diào)節(jié)第16頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三色氨酸操縱子的反饋?zhàn)瓒舻?7頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三DNA（促 進(jìn)）分解代謝物阻遏的乳糖操縱子模

11、型轉(zhuǎn)乙?；刚{(diào)節(jié)基因CAP-cAMPRNApolLacZOLacYLacA阻遏蛋白啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶乳糖阻遏蛋白mRNA半乳糖苷酶透過(guò)酶葡萄糖（阻斷）XATPcAMPCAPAMP葡萄糖分解代謝物X阻止CAP-cAMP 的形成，從而阻止了RNA聚合酶與啟動(dòng)基因上結(jié)合位點(diǎn)(RNApol.)的結(jié)合，即使有誘導(dǎo)物乳糖存在，與乳糖代謝有關(guān)的酶仍無(wú)法合成第18頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三二、酶活性的調(diào)節(jié)通過(guò)改變現(xiàn)成的酶分子活性來(lái)調(diào)節(jié)新陳代謝的速率的方式。是酶分子水平上的調(diào)節(jié)，屬于精細(xì)的調(diào)節(jié)。（一）調(diào)節(jié)方式：包括兩個(gè)方面：1、酶活性的激活：在代謝途徑中后面的反應(yīng)

12、可被較前面的反應(yīng)產(chǎn)物所促進(jìn)的現(xiàn)象；常見(jiàn)于分解代謝途徑。 如：粗糙脈孢霉的異檸檬酸脫氫酶的活性受檸檬酸促進(jìn)2、酶活性的抑制：包括：競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反饋抑制。概念：反饋：指反應(yīng)鏈中某些中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物對(duì)該途徑關(guān)鍵酶活性的影響。 凡使反應(yīng)速度加快的稱(chēng)正反饋； 凡使反應(yīng)速度減慢的稱(chēng)負(fù)反饋（反饋抑制）； 反饋抑制主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物過(guò)量時(shí)可反過(guò)來(lái)直接抑制該途徑中第一個(gè)酶的活性。主要表現(xiàn)在氨基酸、核苷酸合成途徑中。特點(diǎn)：作用直接、效果快速、末端產(chǎn)物濃度降低時(shí)又可解除第19頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三1.直線式代謝途徑中的反饋抑制：蘇氨酸脫氨酶蘇氨酸-酮丁酸異亮氨酸反饋

13、抑制其它實(shí)例：谷氨酸棒桿菌的精氨酸合成2.分支代謝途徑中的反饋抑制：在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復(fù)雜，為了避免在一個(gè)分支上的產(chǎn)物過(guò)多時(shí)不致同時(shí)影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。主要有： 同功酶的調(diào)節(jié)， 順序反饋，協(xié)同反饋，積累反饋調(diào)節(jié)等。（二）反饋抑制的類(lèi)型第20頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（1）同功酶調(diào)節(jié)isoenzyme定義：催化相同的生化反應(yīng)，而酶分子結(jié)構(gòu)有差別的一組酶。意義：在一個(gè)分支代謝途徑中，如果在分支點(diǎn)以前的一個(gè)較早的反應(yīng)是由幾個(gè)同功酶催化時(shí)，則分支代謝的幾個(gè)最終產(chǎn)物往往分別對(duì)這幾個(gè)同功酶發(fā)生抑制作用。某一產(chǎn)物過(guò)量?jī)H抑制相應(yīng)酶

14、活性，對(duì)其他產(chǎn)物沒(méi)影響。舉例：大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié)第21頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（2）協(xié)同反饋抑制concerted feedback inhibition定義：分支代謝途徑中幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)才能抑制共同途徑中的第一個(gè)酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。舉例：谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受賴(lài)氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制和阻遏。第22頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（3）合作反饋抑制cooperative fee

15、dback inhibition定義：兩種末端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，共同的反饋抑制作用大于二者單獨(dú)作用之和。舉例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP （和IMP）的合作反饋抑制，二者共同存在時(shí)，可以完全抑制該酶的活性。而二者單獨(dú)過(guò)量時(shí)，分別抑制其活性的70%和10%。第23頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（4）積累反饋抑制cumulative feedback inhibition定義：每一分支途徑末端產(chǎn)物按一定百分比單獨(dú)抑制共同途徑中前面的酶，所以當(dāng)幾種末端產(chǎn)物共同存在時(shí)它們的抑制作用是積累的，各末端產(chǎn)物之間既無(wú)協(xié)同效應(yīng)，亦無(wú)拮抗作用。第24頁(yè)，共63頁(yè)，

16、2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（5）順序反饋抑制sequential feedback inhibition一種終產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致前一中間產(chǎn)物的積累，通過(guò)后者反饋抑制合成途徑關(guān)鍵酶的活性，使合成終止。舉例：枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸合成的調(diào)節(jié)第25頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（三）反饋抑制的機(jī)制 盡管反饋抑制的類(lèi)型很多，但其主要的作用方式在于末端產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)途徑中調(diào)節(jié)酶的抑制。 受反饋抑制的調(diào)節(jié)酶一般都是變構(gòu)酶，酶活力調(diào)控的實(shí)質(zhì)就是變構(gòu)酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)。 變構(gòu)酶的酶蛋白分子一般都是由兩個(gè)以上亞基組成的多聚體，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，這是能夠產(chǎn)生變構(gòu)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。 變構(gòu)酶

17、分子具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是與底物結(jié)合的催化中心（活性中心），另一個(gè)可與調(diào)節(jié)因子（又稱(chēng)效應(yīng)物）相結(jié)合的調(diào)節(jié)中心（變構(gòu)中心）。第26頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三+激活劑底物+抑制劑無(wú)活性形式活性形式活性形式無(wú)活性形式（不能結(jié)合底物）底物圖 變構(gòu)酶的激活和變構(gòu)酶的抑制 變構(gòu)效應(yīng)：當(dāng)效應(yīng)物與調(diào)節(jié)中心結(jié)合后，可引起酶蛋白分子發(fā)生構(gòu)象變化，從而引起酶的活性中心對(duì)底物的親和力和催化能力的改變，激活或阻礙了酶和它的底物的結(jié)合，促進(jìn)或抑制了酶活力，使整個(gè)代謝途徑的快慢受到調(diào)節(jié)。第27頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三28 突變前 突變后 反饋抑制與抗反饋抑制突

18、變效應(yīng)物底物第28頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三三、反饋?zhàn)瓒襞c反饋抑制的比較 類(lèi)型項(xiàng)目反饋?zhàn)瓒舴答佉种普{(diào)控對(duì)象調(diào)控開(kāi)關(guān)調(diào)控的水平調(diào)控方式調(diào)控動(dòng)作形成的控制調(diào)控反應(yīng)速度酶的合成終產(chǎn)物濃度DNAmRNA酶蛋白（轉(zhuǎn)錄水平）終產(chǎn)物與阻遏蛋白親和力阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合,不能合成mRNA開(kāi)、關(guān)控制遲緩、粗的控制酶的活性終產(chǎn)物濃度酶蛋白的構(gòu)象變化終產(chǎn)物與變構(gòu)部位親和力通過(guò)變構(gòu)效應(yīng),酶的構(gòu)象變化控制酶活性的大小迅速、精確的控制第29頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三第三節(jié) 次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)控制 1. 細(xì)胞生長(zhǎng)期到抗生素產(chǎn)生期的過(guò)渡在細(xì)胞生長(zhǎng)期，負(fù)責(zé)次級(jí)代謝產(chǎn)物合

19、成的酶處于抑制或阻遏狀態(tài)，進(jìn)入穩(wěn)定期，這些酶便開(kāi)始被激活或被合成（解除阻遏作用的原因是多方面的）。(1)一種誘導(dǎo)因子在生長(zhǎng)期末積累或從外源加入以解除生產(chǎn)期的阻遏作用。(2)初級(jí)代謝的終產(chǎn)物對(duì)次級(jí)代謝途徑的反饋?zhàn)瓒糇饔茫?dāng)終產(chǎn)物耗盡后，受阻遏的基因就被解除阻遏。(3)在一種易被利用的糖源中生長(zhǎng)，其分解代謝物對(duì)抗生素合成有阻遏作用，當(dāng)這些阻遏劑被利用后，便解除了阻遏作用。第30頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三2. 酶的誘導(dǎo)作用 在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)期一般不出現(xiàn)催化次級(jí)代謝的酶，在穩(wěn)定期發(fā)生了次級(jí)代謝酶的誘導(dǎo)或解阻遏而生成。如色氨酸（或其類(lèi)似物）刺激麥角菌誘導(dǎo)合成麥角靈生物堿；蛋氨酸刺

20、激頂頭孢霉生物合成頭孢菌素C。(4)抗生素合成途徑受高能化合物的阻遏，當(dāng)ATP形成減少后，阻遏作用隨即解除。(5)在生長(zhǎng)期，RNA聚合酶只能啟動(dòng)生長(zhǎng)期基因的轉(zhuǎn)錄作用，它不能附著在生產(chǎn)期操縱的促進(jìn)子的位置上，結(jié)果次級(jí)代謝途徑的酶合成受阻遏；當(dāng)生長(zhǎng)停止后，酶的結(jié)構(gòu)改變，允許RNA聚合酶啟動(dòng)生產(chǎn)期基因的轉(zhuǎn)錄作用，負(fù)責(zé)抗生素合成的酶開(kāi)始生成。第31頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三3. 分解代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)控制 葡萄糖效應(yīng)（分解產(chǎn)物阻遏）：在含有葡萄糖和第二種碳源的培養(yǎng)基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生素的生物合成，只有在葡萄糖耗盡時(shí)，利用第二種碳源（如半乳糖）所需的酶開(kāi)始合成，并解

21、除對(duì)抗生素生物合成的抑制。此外，甘露糖、甘油也呈現(xiàn)明顯的阻遏作用。第32頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三4. 磷酸鹽的調(diào)節(jié)高濃度磷酸鹽對(duì)許多抗生素合成具有阻遏和抑制作用。高濃度磷酸鹽只長(zhǎng)菌體而不合成抗生素；但磷酸鹽太少時(shí)，菌體生長(zhǎng)不夠，也不利于合成抗生素。因此，發(fā)酵工藝上要嚴(yán)格控制“亞適量”的磷酸鹽濃度。5. NH4的抑制作用在抗生素發(fā)酵中，供給高濃度的容易被利用的無(wú)機(jī)氨態(tài)氮或其他迅速被利用的氮源，由于它們促進(jìn)生長(zhǎng)，而強(qiáng)烈抑制抗生素的合成。第33頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三6. 初級(jí)代謝調(diào)節(jié)對(duì)次級(jí)代謝的作用許多次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)自初級(jí)代謝的關(guān)鍵中

22、間體，因此次級(jí)代謝也就受初級(jí)代謝調(diào)節(jié)的影響。7. 次級(jí)代謝的反饋抑制（或阻遏）許多抗生素能阻止自身的合成。8. 次級(jí)代謝的能荷調(diào)節(jié)能荷調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)次級(jí)代謝途徑的控制也是有效的。第34頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三第四節(jié) 代謝調(diào)節(jié)控制育種 從工業(yè)微生物育種史來(lái)看，誘變育種曾取得了巨大的成就，使微生物有效產(chǎn)物成百倍、乃致成千倍的增加。但是誘變育種工作量繁重，盲目性大。 近年來(lái)由于應(yīng)用生物化學(xué)和遺傳學(xué)原理，深入研究了生物合成代謝途徑以及代謝調(diào)節(jié)控制的基礎(chǔ)理論： （1）可進(jìn)行外因控制，通過(guò)培養(yǎng)條件來(lái)解除反饋調(diào)節(jié)而使生物合成的途徑朝著人們所希望的方向進(jìn)行，即實(shí)現(xiàn)代謝控制發(fā)酵；第3

23、5頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（2）還可進(jìn)行內(nèi)因改變，通過(guò)定向選育某種特定的突變株，以達(dá)到大量積累有益產(chǎn)物的目的，即所謂代謝控制育種。 內(nèi)因是變化的根據(jù)，所以改變微生物的遺傳型往往是控制代謝的更為有效的途徑。 代謝控制育種可以大大減少傳統(tǒng)育種的盲目性，提高了效率。 代謝控制育種很快在初級(jí)代謝產(chǎn)物的育種中得到廣泛的應(yīng)用，成就也十分顯赫，幾乎全部氨基酸和多種核苷酸生產(chǎn)菌株都被打上了抗性或缺陷型遺傳標(biāo)記。第36頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三 代謝調(diào)節(jié)控制育種通過(guò)特定突變型的選育，達(dá)到改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細(xì)

24、胞膜的透性，使代謝流向目的產(chǎn)物積累方向進(jìn)行。下表列出微生物代謝控制育種措施第37頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三調(diào)節(jié)體系育種措施誘導(dǎo)分解阻遏分解抑制 1.組成型突變株的選育2.抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源分解調(diào)節(jié)突變株的選育解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育反饋?zhàn)瓒舴答佉种?.營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的選育4.滲漏型缺陷型突變株的選育5.回復(fù)突變株的選育6.耐自身代謝產(chǎn)物的突變株的選育7.抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的突變株的選育8.耐前體物突變株的選育9.條件突變株的選育細(xì)胞膜滲透性10.營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的選育生物素缺陷型油酸缺陷型甘油缺陷型11.溫敏突變株第38

25、頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三一、組成型突變株的選育組成型突變株：在沒(méi)有誘導(dǎo)底物存在時(shí)也能產(chǎn)生大量誘導(dǎo)酶的突變株。 篩選原理：通過(guò)誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成型酶。 第39頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三40 篩選方法及實(shí)例： 創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長(zhǎng)而不利于誘導(dǎo)型菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，造成對(duì)組成型突變株的選擇優(yōu)勢(shì)； 選擇適當(dāng)?shù)蔫b別培養(yǎng)基，直接在平板上識(shí)別兩類(lèi)菌落，從而把組成型突變株選擇出來(lái)。第40頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三

26、41 限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)法 控制低于誘導(dǎo)濃度的誘導(dǎo)物作碳源進(jìn)行恒化連續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)型菌株生長(zhǎng)極弱，而變異株由于能產(chǎn)分解底物的酶，則能分解底物而得以生長(zhǎng)。通過(guò)連續(xù)不斷加入新鮮基質(zhì)，野生型就會(huì)被“洗出”，組成型突變株就被不斷“濃縮” ，最后達(dá)到能分離的濃度。第41頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三42 循環(huán)培養(yǎng)法 不含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基 含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基 (普通碳源或氮源） （誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源） 兩菌都能生長(zhǎng)，但組成型突變株已能合成特定的酶，親株不能變異株調(diào)整期短，親株調(diào)整期長(zhǎng)，短時(shí)間培養(yǎng)后，變異株所占比例增大 反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)幾次后，變異株所占比例逐漸提高，然后進(jìn)行分離 第42頁(yè)，

27、共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三鑒別性培養(yǎng)基的利用 將誘變孢子懸液涂布在甘油作唯一碳源的平板上，培養(yǎng)后長(zhǎng)出菌落。 然后在菌落上噴上O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），組成型成黃色，誘導(dǎo)型呈白色。 原因：組成型突變株在沒(méi)有誘導(dǎo)底物存在時(shí)仍能產(chǎn)生-半乳糖苷酶，將無(wú)色試劑水解，放出O-硝基苯酚，因而很容易挑選。第43頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三44 篩選 經(jīng)誘變劑處理后的菌體移接到含有誘導(dǎo)能力低，但能作為良好碳源的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，突變體能良好生長(zhǎng)，野生型不能生長(zhǎng)。 例如：利用苯-半乳糖（PG）篩選-半乳糖苷酶組成型突變株。 第44頁(yè)，共63頁(yè)

28、，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三二、營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用（一）在初級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用1.在直線式生物合成途徑中第45頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸量，這樣就將反饋?zhàn)饔梦餄舛瓤刂圃诜答仚C(jī)制的濃度之下）谷氨酸N-乙酰-谷氨酰磷酸N-乙酰谷氨酸半縮醛N-乙酰鳥(niǎo)氨酸鳥(niǎo)氨酸瓜氨酸精氨酸N-乙酰谷氨酸- -反饋 抑制谷氨酸棒狀桿菌（瓜氨酸缺陷型）的鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵代謝控制機(jī)制-第46頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三2.在分支式生物合成途徑中-協(xié)同反饋抑制天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬

29、氨酸半縮酸醛高絲氨酸蘇氨酸賴(lài)氨酸天冬氨酸激酶-谷氨酸棒狀桿菌（高絲氨酸缺陷型）的L-賴(lài)氨酸發(fā)酵代謝控制機(jī)制第47頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三分支途徑肌苷酸發(fā)酵（IMP合成途徑的代謝調(diào)控）調(diào)控理論的實(shí)踐應(yīng)用第48頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三（二）在次級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用（自學(xué)）三、滲漏缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用。 滲漏缺陷型是一種特殊的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其特點(diǎn)是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養(yǎng)基上少量生長(zhǎng)。獲得滲漏型的方法是把大量營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株接種在基本培養(yǎng)基平板上，挑選生長(zhǎng)特別慢而菌落小的即可。 可以利

30、用滲漏缺陷型既能少量地合成代謝終產(chǎn)物，又不造成反饋抑制的現(xiàn)象。篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株，其原理類(lèi)似于營(yíng)養(yǎng)缺陷型，只是不必添加限量的缺陷營(yíng)養(yǎng)屋。第49頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三四、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育(一)反饋調(diào)節(jié)和抗反饋調(diào)節(jié)突變 1.反饋調(diào)節(jié) 是指當(dāng)合成代謝途徑的終產(chǎn)物或分支代謝途徑的終產(chǎn)物過(guò)量積累時(shí)，抑制合成代謝途徑的關(guān)鍵酶（往往是代謝途徑或分支代謝途徑第一步的酶）的活力或相關(guān)酶的合成。反饋調(diào)節(jié)分為反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簟?第50頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三51 反饋抑制是指合成代謝途徑終產(chǎn)物過(guò)量積累時(shí)對(duì)該途徑前端某些關(guān)鍵酶酶活性的抑制作用

31、。 反饋?zhàn)瓒羰侵肝⑸锖铣纱x中高濃度終產(chǎn)物對(duì)該途徑上酶合成的抑制作用。 反饋抑制直接以產(chǎn)物濃度控制關(guān)鍵酶的活性，從而控制整個(gè)代謝途徑，具有快速、有效、經(jīng)濟(jì)和直接的特點(diǎn)。反饋?zhàn)瓒糇饔檬前麅?nèi)產(chǎn)物過(guò)量后終止酶合成的一種機(jī)制，與反饋抑制相比，反應(yīng)較慢，并且往往影響代謝途徑中所有酶（整個(gè)操縱子）的合成。第51頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三52 2.抗反饋調(diào)節(jié)突變 是指解除了反饋調(diào)節(jié)的突變株，包括抗反饋抑制突變和抗反饋?zhàn)瓒敉蛔儭?抗反饋抑制突變是指解除了反饋抑制的突變株。（調(diào)節(jié)中心發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，無(wú)法與效應(yīng)物結(jié)合） 抗反饋?zhàn)瓒敉蛔兪侵附獬朔答佔(zhàn)瓒舻耐蛔冎?。（調(diào)節(jié)基因突變或操縱基

32、因突變） 第52頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三53 3.抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選 篩選抗結(jié)構(gòu)類(lèi)似物突變株 利用回復(fù)突變篩選 初級(jí)代謝產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株（野生型營(yíng)養(yǎng)缺陷型原養(yǎng)型） 次級(jí)代謝產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株（野生型營(yíng)養(yǎng)缺陷型原養(yǎng)型） 次級(jí)代謝產(chǎn)物零產(chǎn)量回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株（高產(chǎn)株零變株高產(chǎn)株） 第53頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三54 (二)抗代謝類(lèi)似物突變型的篩選1.代謝類(lèi)似物與抗代謝類(lèi)似物突變 代謝類(lèi)似物：結(jié)構(gòu)與（初級(jí)）代謝物類(lèi)似，因此可起到代謝物所具有的調(diào)節(jié)作用而不具備其生理功能的一類(lèi)化合物。 第54頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三55 Threonine AHV -Amino-hydroxyvaleric acid -氨基-羥基戊酸第55頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三56 Lys AEC S-(2-Aminoethyl)-L-CysteineS-（2氨基乙基）-L半胱氨酸第56頁(yè)，共63頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)24分，星期三57 真正代謝物功能