1、PAGE 11 -新冠肺炎患者和細(xì)菌性肺炎患者血清差異表達(dá)的細(xì)胞因子特征分析羅斯威姚亞超鐘麗梅胡亮杉肖威方曉琳曹東林【摘要】目的了解新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）患者與細(xì)菌性肺炎患者細(xì)胞因子的差異，探討新冠肺炎免疫病理機(jī)制，為新冠肺炎提供新的治療靶點(diǎn)。方法收集輕型新冠肺炎患者（新冠肺炎組）、細(xì)菌性肺炎患者（細(xì)菌性肺炎組）和健康志愿者（健康對(duì)照組）3組各15份血清標(biāo)本，進(jìn)行48種細(xì)胞因子的檢測(cè)，比較3組間細(xì)胞因子表達(dá)譜的差異。檢測(cè)10例新冠肺炎患者在治療不同時(shí)間點(diǎn)的血清標(biāo)本中48種細(xì)胞因子表達(dá)，分析其與新冠肺炎患者的臨床特征及疾病進(jìn)展的相關(guān)性。結(jié)果新冠肺炎組與細(xì)菌性肺炎組比較中，巨噬細(xì)胞遷移抑制因

2、子（MIF）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因（GRO）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和TNF-在新冠肺炎組中上調(diào)（P均0.05）。而IL-10、IL-18、IL-2受體和IFN-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞因子（MIG）在細(xì)菌性肺炎組中上調(diào)（P均0.05）。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）在新冠肺炎患者住院治療的第2周有明顯的下調(diào);單核趨化蛋白-1（MCP-1）的變化與新冠肺炎患者的核酸檢測(cè)結(jié)果變化一致。結(jié)論新冠肺炎患者和細(xì)菌性肺炎患者體內(nèi)存在不同的細(xì)胞因子表達(dá)譜。M-CSF和MCP-1在新冠肺炎疾病進(jìn)展中起著重要作用?！娟P(guān)鍵詞】新型冠狀病毒肺炎;細(xì)菌性肺炎;細(xì)胞因子;表達(dá)譜【Abstract】Obje

3、ctiveToinvestigatethedifferencesofcytokineprofilesbetweenpatientswithnovelCOVID-19andbacterialpneumonia，unraveltheimmunopathologicalmechanismofCOVID-19，andprovideevidencefornewtherapeutictargetsinCOVID-19.MethodsInthisstudy，15serumsampleswerecollectedfrommildCOVID-19patients（COVID-19group），bacterial

4、pneumoniapatients（bacterialpneumoniagroup），andhealthycontrols（healthycontrolgroup），respectively.Theexpressionprofileof48cytokineswasdeterminedtoclarifythedifferencesamongthreegroups.Theexpressionlevelsof48cytokinesatdifferenttimepointsweremeasuredinserumsamplesfrom10patientswithCOVID-19toanalyzethei

5、rcorrelationwithclinicalfeaturesanddiseaseprogression.ResultsInthecomparationbetweentheCOVID-19groupandthebacterialpneumoniagroup，theexpressionlevelsofMIF，GRO，GM-CSFandTNF-wereupregulatedinCOVID-19patients（allP0.05），whereasthoseofIL-10，IL-18，IL-2RandMIGwereupregulatedinpatientswithbacterialpneumonia

6、（allP0.05）.TheexpressionlevelofM-CSFwassignificantlydownregulatedinCOVID-19patientsatthesecondweekofhospitalization.ThechangesintheexpressionlevelofMCP-1wereconsistentwiththenucleicacidtestresultsofCOVID-19patients.ConclusionsThecytokineprofilesdifferbetweenpatientswithCOVID-19andbacterialpneumonia.

7、Inaddition，M-CSFandMCP-1playcriticalrolesintheprogressionofCOVID-19.【Keywords】COVID-19;Bacterialpneumonia;Cytokine;profile在全球范圍內(nèi)傳播的新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的。該病毒是冠狀病毒科的一種單鏈RNA病毒，主要感染呼吸道和腸道，引起多種癥狀1。雖然大多數(shù)新冠肺炎患者僅有輕微或中度的癥狀，但也有一部分患者會(huì)發(fā)展為嚴(yán)重的肺炎乃至需要機(jī)械通氣的ARDS2。人類(lèi)感染SARS-CoV-2的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前尚未有針

8、對(duì)該病毒的特效抗病毒藥物，因此該病的治療主要集中在對(duì)癥治療和氧療3。免疫功能是對(duì)侵入性病原體的強(qiáng)有力防御。機(jī)體受感染后，體內(nèi)活躍的免疫反應(yīng)被描述為細(xì)胞因子風(fēng)暴，表現(xiàn)為分泌大量的促炎細(xì)胞因子及趨化因子。細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征（CSS）可由多種疾病引起，在臨床上CSS通常表現(xiàn)為全身炎癥，MODS和炎癥因子水平迅速大幅度升高4。新冠肺炎患者體內(nèi)存在的CSS與包括ARDS在內(nèi)的廣泛組織損傷有關(guān)5。然而其與普通細(xì)菌性肺炎致病機(jī)制之間的差異仍未闡明。本研究選擇調(diào)控細(xì)胞間信號(hào)通路并在炎癥、急性或慢性疾病中發(fā)揮重要作用的48種細(xì)胞因子，評(píng)價(jià)新冠肺炎患者和細(xì)菌性肺炎患者、健康人的細(xì)胞因子特征差異，以明確新冠肺炎與細(xì)

9、菌性肺炎細(xì)胞因子表達(dá)譜間的差異，為開(kāi)展針對(duì)性防控新冠肺炎提供科學(xué)理論依據(jù)。材料與方法一、研究對(duì)象選擇2022年1月24日至3月6日在廣東省第二人民醫(yī)院住院治療的15例輕型新冠肺炎患者（新冠肺炎組），共收集其住院前和住院后不同時(shí)間點(diǎn)的57份血清樣本，該批樣本均為常規(guī)生化檢查后的剩余血清樣本。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)新冠肺炎診療方案（試行第五版）：SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性，有發(fā)燒、干咳等臨床表現(xiàn)，且CT顯示肺部有毛玻璃狀陰影。收集同期住院的15例細(xì)菌性肺炎患者（細(xì)菌性肺炎組），診斷標(biāo)準(zhǔn)為：SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性，有肺炎臨床表現(xiàn)且痰液或血液培養(yǎng)出革蘭陽(yáng)性或陰性菌。收集同期15名健康志愿者（健康

10、對(duì)照組），入組標(biāo)準(zhǔn)為：SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性，無(wú)任何不適。本研究經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2022-KZ-141-01），所有患者均已簽署知情同意書(shū)。二、標(biāo)本處理及48種細(xì)胞因子檢測(cè)非抗凝血的收集步驟：3500轉(zhuǎn)/分離心5min，在離體6h內(nèi)收集常規(guī)生化檢查后的剩余血清樣本，凍存于20備用。采用細(xì)胞因子48-plex篩選檢測(cè)試劑盒以液相芯片法檢測(cè)48種細(xì)胞因子，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。在比較3組間差異表達(dá)的細(xì)胞因子時(shí)，新冠肺炎組與細(xì)菌性肺炎組均使用入院后首次采集的血清標(biāo)本。從新冠肺炎組15例患者中選取動(dòng)態(tài)血清數(shù)據(jù)較為完善的10例，收集其治療不同時(shí)間點(diǎn)的血清標(biāo)本檢測(cè)4

11、8種細(xì)胞因子，分析其水平與新冠肺炎患者的疾病進(jìn)展間的相關(guān)性，并從10例中選取3例，收集其核酸由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性的動(dòng)態(tài)追蹤的血清樣本共24份，分析細(xì)胞因子與新冠肺炎患者的疾病進(jìn)展和細(xì)胞因子特征之間的相關(guān)性。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用Graphpad8.0處理數(shù)據(jù)。3組受檢者的血清細(xì)胞因子水平采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，若組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再采用Nemenyi檢驗(yàn)。新冠肺炎患者治療不同時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，同一患者治療前和治療后第2周的數(shù)據(jù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：=0.05。結(jié)果一、3組受檢者的臨床特征新冠肺炎組中，男9例、女6例，年齡（42.715.7）歲，淋巴細(xì)胞絕

12、對(duì)值為（1.480.61）109/L，3例合并基礎(chǔ)性疾病，分別為糖尿病、COPD和慢性肝臟疾病，初始癥狀主要為發(fā)燒、干咳、咳痰、氣促、咽痛、肌痛和腹瀉。細(xì)菌性肺炎組中，男9例、女6例，患者年齡（69.024.0）歲，淋巴細(xì)胞絕對(duì)值為（1.280.67）109/L，9例合并基礎(chǔ)性疾病，分別為高血壓、糖尿病、COPD、慢性心力衰竭和腦梗死等多種疾病。健康對(duì)照組中，男8名、女7名，志愿者年齡（55.815.0）歲，淋巴細(xì)胞絕對(duì)值為（2.090.58）109/L。二、僅在細(xì)菌性肺炎組中增多的細(xì)胞因子與健康對(duì)照組比較，IL-2、IL-4、IL-10、IL-16、IL-17、IL-18、巨噬細(xì)胞集落刺激因

13、子（M-CSF）、白血病抑制因子（LIF）和IFN-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞因子（MIG）僅在細(xì)菌性肺炎組中升高（P均0.05），而在新冠肺炎組中未見(jiàn)升高（P均0.05），見(jiàn)圖1。三、同時(shí)在細(xì)菌性肺炎組和新冠肺炎組中增多的細(xì)胞因子與健康對(duì)照組比較，IFN-2、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）、IL-15、IL-2受體（IL-2R）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因（GRO）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）同時(shí)在細(xì)菌性肺炎組和新冠肺炎組中升高（P均0.05），見(jiàn)圖2。四、僅在新冠肺炎組中水平發(fā)生變化的細(xì)胞因子與細(xì)菌性肺炎及健康對(duì)照組比較，IFN-誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1（MIP-1）、

14、IL-5、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、IL-1受體拮抗劑（IL-1ra）、TNF-和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-（SCGF-）等細(xì)胞因子僅在新冠肺炎組中升高（P均0.05），見(jiàn)圖3。五、細(xì)菌性肺炎組和新冠肺炎組差異表達(dá)的細(xì)胞因子新冠肺炎組與細(xì)菌性肺炎組的比較中，MIF、GRO、GM-CSF和TNF-在新冠肺炎組中上調(diào)（P均0.05），而IL-10、IL-18、IL-2R和MIG在細(xì)菌性肺炎組中上調(diào)（P均0.05），見(jiàn)圖13。六、新冠肺炎組中與疾病進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞因子新冠肺炎組中，與治療前相比，M-CSF的含量在治療第2周下降。在SARS-CoV-2核酸轉(zhuǎn)陰的進(jìn)程中先下降隨后維持在一定水平;單核趨化蛋

15、白-1（MCP-1）的含量與SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性有關(guān)，即在SARS-CoV-2核酸轉(zhuǎn)陰的進(jìn)程中MCP-1水平逐漸下降，見(jiàn)圖4。3例核酸由陽(yáng)性轉(zhuǎn)陰性的新冠肺炎患者M(jìn)CP-1和M-CSF的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖5。討論新冠肺炎發(fā)病過(guò)程中（尤其是危重癥患者）會(huì)出現(xiàn)的許多癥狀和相關(guān)病理過(guò)程，均是由細(xì)胞因子和CSS引發(fā)的。在危重癥患者中，免疫反應(yīng)可能失控，因此細(xì)胞因子暴發(fā)類(lèi)似于繼發(fā)性噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥，可能導(dǎo)致MODS，如果救治不及時(shí)，可造成患者死亡6。結(jié)合抗菌藥物和免疫療法的治療策略可能會(huì)產(chǎn)生更好的效果7-8。因此，本研究期望尋找新冠肺炎區(qū)別于細(xì)菌性肺炎的發(fā)生機(jī)制，闡明與新冠肺炎發(fā)病及與其病程密

16、切相關(guān)的細(xì)胞因子，為后續(xù)開(kāi)發(fā)加強(qiáng)抗病毒免疫和避免過(guò)度炎癥損害的免疫調(diào)節(jié)療法，以防止或減少導(dǎo)致器官損傷和疾病進(jìn)展的細(xì)胞因子釋放的策略提供更多的證據(jù)。本研究根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)SARS-CoV-2診療方案（試行第五版）納入了15例輕型新冠肺炎患者，并詳細(xì)分析了其血清細(xì)胞因子和趨化因子的變化。細(xì)胞因子在SARS-CoV-2感染的病理生理學(xué)中起著重要作用，已有報(bào)道IL-2、sIL-2R、IL-7、MCP-1、M-CSF、IFN-等多個(gè)細(xì)胞因子在SARS-CoV-2、SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）感染患者中升高9-10。本研究顯示，與健康對(duì)照組相比，入院時(shí)新冠肺炎組患者I

17、型IFN中的IFN-2、LIF、MIF、IL-5、IL-15、SDF-1等13種細(xì)胞因子升高。既往文獻(xiàn)報(bào)道，重型新冠肺炎患者均存在CSS，2組間大部分細(xì)胞因子在發(fā)病不同階段水平相當(dāng)11。本研究表明，輕型新冠肺炎患者體內(nèi)也存在CSS。本研究所分析的新冠肺炎或者細(xì)菌性肺炎患者血清均為入院后首次采集的治療前的血清標(biāo)本，新冠肺炎采血前患者未給予腎上腺皮質(zhì)激素、靜脈注射Ig或利巴韋林等免疫調(diào)節(jié)劑。本研究的輕型新冠肺炎患者中并沒(méi)有出現(xiàn)IL-1、IL-6和TNF-的上調(diào)，提示包括IL-1、IL-6和TNF抑制劑的抗細(xì)胞因子療法不適用于輕型新冠肺炎患者。上述特異改變的細(xì)胞因子有可能作為細(xì)菌性肺炎和新冠肺炎的鑒

18、別診斷標(biāo)志物，此外對(duì)于合并細(xì)菌性肺炎感染的新冠肺炎患者的免疫治療具有一定的指導(dǎo)意義。有研究者發(fā)現(xiàn)，新冠肺炎患者的IL-6水平可根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度而有所不同12。文獻(xiàn)報(bào)道，使用妥珠單抗即IL-6受體的抗體治療新冠肺炎患者的效果差，并且沒(méi)有阻止其進(jìn)展為繼發(fā)性噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增多癥13。這表明IL-6可能是疾病進(jìn)展的主要指標(biāo)，但并不是唯一的驅(qū)動(dòng)因素。與之相反的是，本研究中輕型新冠肺炎患者血清中IL-6未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上調(diào)，可能是樣本量差異，或者可能是不同亞型病毒導(dǎo)致的細(xì)胞因子改變情況不一致。阻斷IL-6受體的抗體妥珠單抗，用于臨床治療輕型新冠肺炎患者的免疫抑制療法值得商榷。筆者在比較新冠肺炎和

19、細(xì)菌性肺炎2組細(xì)胞因子差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，MIF、GRO、GM-CSF和TNF-在新冠肺炎組有較高的表達(dá)水平，而IL-10、MIG、IL-2R和IL-18在細(xì)菌性肺炎中有較高的表達(dá)水平，提示這些細(xì)胞因子在不同類(lèi)別病原微生物導(dǎo)致的肺炎中的免疫致病機(jī)制和機(jī)體反應(yīng)存在差異。本研究進(jìn)一步分析了上述細(xì)胞因子是否可以用來(lái)預(yù)測(cè)新冠肺炎的疾病進(jìn)展，應(yīng)用新冠肺炎患者住院治療的不同時(shí)期收集的連續(xù)血清標(biāo)本分析細(xì)胞因子在個(gè)體疾病進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)變化。其中有3例患者的血標(biāo)本收集時(shí)間點(diǎn)較多，與核酸檢測(cè)結(jié)果配合，可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子在病毒核酸轉(zhuǎn)陰過(guò)程中細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示MCP-1在核酸檢測(cè)結(jié)果從陽(yáng)性變?yōu)殛幮缘倪^(guò)程中明顯下降。這

20、與之前報(bào)道MCP-1在新冠肺炎和SARS等疾病急性期早期迅速升高，并隨著疾病進(jìn)展逐漸降低結(jié)論一致，進(jìn)一步證實(shí)MCP-1與新冠肺炎患者的疾病進(jìn)展相關(guān)14-15。目前對(duì)人類(lèi)感染SARS-CoV-2發(fā)病機(jī)制提出的假說(shuō)認(rèn)為重型新冠肺炎患者經(jīng)歷3個(gè)臨床階段：病毒血癥期、急性期和恢復(fù)期。急性期大約為發(fā)病后第714日，急性期患者病情加重，中性粒細(xì)胞、D-二聚體、血尿素氮和血清肌酐水平升高16。有文獻(xiàn)報(bào)道M-CSF水平在輕型新冠肺炎患者中升高，但并未詳細(xì)分析治療后第2周的改變情況，也沒(méi)有分析M-CSF動(dòng)態(tài)變化與臨床特征的相關(guān)性11。本研究中，輕型新冠肺炎患者的M-CSF水平在住院治療第2周出現(xiàn)下降，推測(cè)新冠肺

21、炎患者治療第2周M-CSF處于抑制狀態(tài)，隨后恢復(fù)期患者血清中M-CSF水平增高，維持到一定水平后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。提示M-CSF可用于監(jiān)測(cè)新冠肺炎患者的病程，并可用于新冠肺炎疾病療效評(píng)估。有學(xué)者對(duì)感染SARS-CoV-2早期康復(fù)者的單細(xì)胞RNA序列分析結(jié)果表明，IL-1和M-CSF可能是與細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)的炎癥反應(yīng)新介質(zhì)17。本研究結(jié)果加深了對(duì)SARS-CoV-2感染的免疫病理機(jī)制的理解，并提出了使用針對(duì)這些細(xì)胞因子特別是M-CSF這一新的免疫調(diào)節(jié)劑治療策略。綜上所述，本研究分析了新冠肺炎患者和細(xì)菌性肺炎患者鑒別診斷的標(biāo)志物，與SARS-CoV-2感染病程密切相關(guān)的細(xì)胞因子MCP-1和M-CS

22、F有望成為新冠肺炎病情監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物。參考文獻(xiàn)1ZhengJ.SARS-CoV-2：anemergingcoronavirusthatcausesaglobalthreat.IntJBiolSci，2022，16（10）：1678-1685.2YangX，YuY，XuJ，etal.ClinicalcourseandoutcomesofcriticallyillpatientswithSARS-CoV-2pneumoniainWuhan，China：asingle-centered，retrospective，observationalstudy.LancetRespirMed，2022，8（5）

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