1、羧基熒光素乙酰乙酸對大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外染色的研究【摘要】目的討論活體染料羧基熒光素乙酰乙酸FSE標(biāo)記大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞Ss的可行性和最適條件。方法清潔型SD大鼠20只，用密度梯度離心結(jié)合貼壁法別離、純化、培養(yǎng)大鼠Ss，取長滿2525培養(yǎng)瓶瓶底的第3代大鼠Ss，用2.5，5，10，20，40l/L的FSE分別作用1，5，10，15，20in后染色，通過觀察染色后細(xì)胞熒光強(qiáng)度和細(xì)胞貼壁率挑選出FSE標(biāo)記大鼠Ss的最正確標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度。采用TT法檢測最正確條件FSE標(biāo)記的大鼠Ss的增殖才能。結(jié)果濃度10l/L的FSE在37下孵育10in為Ss染色、觀察和研究的最正確條件。此條件下，F(xiàn)SE標(biāo)記

2、的Ss的增殖才能不受影響。結(jié)論活體染料FSE是一種標(biāo)記率高、細(xì)胞毒性孝操作簡便的標(biāo)記大鼠Ss的新方法，濃度10l/L的FSE在37下孵育10in為FSE標(biāo)記大鼠Ss的最正確條件。【關(guān)鍵詞】熒光素；乙酰乙酸鹽類；骨髓細(xì)胞；間質(zhì)干細(xì)胞；染色與標(biāo)記；大鼠1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動物選用清潔級安康雄性SD大鼠20只，23月齡，體質(zhì)量150250g福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SXK(閩20220008)。1.2方法1.2.2FSE染色及最正確條件挑選2.5gFSE用500L二甲基亞楓DS溶解，制成10l/L的儲存液，放于20冰箱內(nèi)保存。臨用前取適量，用Ss培養(yǎng)基分別稀釋成2.5，5

3、，10，20，40l/L的不同濃度。取長滿2525培養(yǎng)瓶瓶底的第3代大鼠Ss26瓶，其中1瓶做等量空白對照，其余25瓶分5組，每組5瓶，分別參加含不同濃度FSE的Ss培養(yǎng)基5L，置37培養(yǎng)箱分別孵育1，5，10，15，20in。用PBS漂洗3次，490n激發(fā)波長熒光顯微鏡下觀察FSE標(biāo)記情況。標(biāo)記率為：標(biāo)記率暗視野所見發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/明視野所見的細(xì)胞數(shù)100530n發(fā)射波長激光共聚焦顯微鏡下測定細(xì)胞熒光強(qiáng)度每瓶隨機(jī)取10個細(xì)胞。隨后用0.25%胰酶含0.1%EDTA液1L消化，離心管離心1000r/in,2in。棄去上清，用含10%FBS培養(yǎng)基6L吹打成單細(xì)胞懸液。每瓶取1L懸液進(jìn)展臺盼藍(lán)

4、染色，觀察Ss的存活率：存活率光鏡下活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100其余懸液按12的比例接種于2525培養(yǎng)瓶中，24h后觀察記錄Ss的貼壁率：貼壁率(倒置相差顯微鏡下接種細(xì)胞數(shù)未貼壁的細(xì)胞數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)100上述步驟重復(fù)4次，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析挑選出FSE標(biāo)記大鼠Ss的最正確標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度。1.2.3標(biāo)記細(xì)胞增殖才能檢測取第3代Ss接種于96孔板中，每孔體積100L，細(xì)胞數(shù)為1103。實(shí)驗(yàn)分2組：FSE標(biāo)記組選用最正確標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度的FSE進(jìn)展標(biāo)記和未標(biāo)記組，每組35孔，每天一樣時間每組各取5孔細(xì)胞，參加TT溶液20L5g/L,37培養(yǎng)箱孵育4h后用全自動酶標(biāo)儀在490n波長測定其光吸收值D49

5、0，連續(xù)7d，并繪制生長曲線。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以xs表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對所得數(shù)據(jù)進(jìn)展t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1Ss的體外培養(yǎng)與鑒定Ss培養(yǎng)24h后逐漸貼壁，其他血細(xì)胞通過換液逐漸除去，此時貼壁細(xì)胞共同特點(diǎn)是呈巨單核細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不一，可有梭形、多角形或星芒狀突起，為單個或多個細(xì)胞的克隆，細(xì)胞增殖迅速。1214d，90%細(xì)胞交融，交融細(xì)胞均呈梭形圖1，原代可獲得11062106個SS。體外擴(kuò)增5代細(xì)胞數(shù)約為11011個Ss。流式細(xì)胞儀檢測10份第2代細(xì)胞樣本，結(jié)果顯示：D34、D45表達(dá)陰性，D29、D90表達(dá)陽性。圖1原代大鼠骨髓間

6、質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)相差顯微鏡，100略Fig1RatsSsfpriarygeneratin(phasentrastirspe,100)2.2FSE標(biāo)記結(jié)果FSE標(biāo)記各組Ss后，熒光顯微鏡下觀察，所有細(xì)胞都被標(biāo)記呈綠色熒光，標(biāo)記率達(dá)100。整個細(xì)胞包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都被標(biāo)記上綠色熒光圖2A,2B。臺盼藍(lán)染色結(jié)果說明，F(xiàn)SE標(biāo)記的各組Ss的存活率為100圖2。A.明視野倒置熒光顯微鏡，100；B.暗視野倒置熒光顯微鏡，100；.臺盼藍(lán)染色光學(xué)顯微鏡，40.圖2羧基熒光素乙酰乙酸標(biāo)記的第三代大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞略Fig2RatsSsf3rdgeneratinlabeledithFSE2.3最正確染色

7、條件挑選結(jié)果FSE標(biāo)記各組Ss的貼壁率和熒光強(qiáng)度分別見表1，2。5種濃度的FSE分別作用1,5,10,15,20in，其細(xì)胞貼壁率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，作用15in和20in組細(xì)胞貼壁率明顯低于其它3組F=62.429，P0.01，進(jìn)一步單因素方差分析顯示，1，5，10in3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.176,P0.05)，而20in組細(xì)胞貼壁率明顯低于15in組F=67.826，P0.01。各組Ss的熒光強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，作用10，15，20in組熒光強(qiáng)度明顯高于其它2組F=87.571，P0.01，進(jìn)一步單因素方差分析顯示，10，15，20in3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.478,P0

8、.05)，而1in和5in組差異有顯著性意義F=147.357，P0.01，5in組熒光強(qiáng)度明顯高于1in組。因此選擇10in作為最正確染色時間。5種不同濃度的FSE染色10in，其細(xì)胞貼壁率的單因素方差分析顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2.5，5，10l/L組細(xì)胞貼壁率明顯高于其它2組F=72.265，P0.01，進(jìn)一步單因素方差分析顯示，2.5，5，10l/L3組細(xì)胞貼壁率差異無顯著性意義(F=1.957,P0.05)；5種不同濃度的FSE染色10in，其熒光強(qiáng)度的單因素方差分析顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義F=78.313，P0.01，熒光強(qiáng)度隨著濃度增加而增強(qiáng)。因此選擇10l/L作為最正確染色濃度。2.4最正確條件FSE標(biāo)記的Ss的增殖才能最適條件FSE標(biāo)記組和未標(biāo)記組的光吸收值D490差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義配對t檢驗(yàn)，P0.05，說明在最適條件下，F(xiàn)SE標(biāo)記的Ss的增殖才能不受影響。2組的生長曲線見圖3。表1不同濃度、不同作用時間羧基熒光素乙酰乙酸標(biāo)記的髓間質(zhì)干細(xì)胞貼壁率略Tab1AdhesiveratefSsafterlabeledbyFSEithdifferentnentratinsanddifferentinubatintien=50.表中數(shù)據(jù)為%.轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.表2不同濃度、不同作用時間羧