1、廣西藤茶提取物TTF抗鴨乙型肝炎病毒的實驗研究【摘要】目的觀察從廣西藤茶中提取出的一有效部位TTF抗鴨乙型肝炎病毒的作用。方法選1日齡北京雛鴨，人工感染鴨乙型肝炎病毒DHBV動物模型，應用斑點雜交法觀察TTF對鴨血清鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)的影響。結果DHBV感染鴨在感染后第7天口服TTF藥物治療，75150g/kg組2次/d，10d對鴨血清DHBV-DNA程度有一定的抑制效果；300g/kg組，對感染鴨血清DHBV-DNA程度的抑制作用顯著，停藥3d未見明顯的反跳現(xiàn)象。結論TTF可明顯抑制DHBV-DNA復制，提示TTF有抗HBV的作用?！娟P鍵詞】藤茶鴨乙型肝炎病毒(DHBV

2、)鴨乙肝動物模型Abstrat:bjetiveTinvestigatetheanti-HBVeffetfTTF.ethds1-dayldBEijingduklingsereusedasthehepatitisBanialdel.DHBVDNAasdetetedbydt-blthybridizatintest.ResultsAfterediatedithTTFfr5daysand10days,ptialdensityvalue(Dvalue)fDHBV-DNAinduklingsseraasbviuslylerthanthatbefretreatent,thereeredifferentinfl

3、uenesindifferentgrupsandrebundphenenndidntappearinbthTTF-grups3daysafterstppingediatin.nlusinTTFiseffiientintreatingDHBV,hihindiatesthatTTFhasananti-HBVeffet.Keyrds:Tengha;DukhepatitisBvirus;Dukhepatitisdel藤茶系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄ApelpsisgrssedentataHand-azz.T.ang的嫩莖葉，在廣西、廣東、云南、貴州、福建等均有分布，亦稱甜藤茶、田婆茶、烏蘞、紅五爪金

4、龍、大齒蛇葡萄。其味甘、淡，性涼，具有清熱解毒、祛風濕、強筋骨、消腫止痛之成效。藤茶在民間流傳應用已有數(shù)百年歷史，是瑤族群眾的家常備用藥。民間用于治療黃疸型肝炎，感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，急性結膜炎或水煎外洗治療癰瘡濕毒等13。藤茶主要成分是黃酮類化合物，含量約為45.52%4。鄭氏5研究結果說明藤茶總黃酮對2215細胞分泌的HBsAg抑制率為43.14%,半數(shù)有效劑量(I50)為40.21g/l,治療指數(shù)(SI)為3.11；對2215細胞分泌的HBeAg抑制率為33.76%；對HBV-DNA有一定抑制作用。為此，筆者對TTF進展體內抗鴨乙型肝炎病毒的實驗研究。現(xiàn)報道如下。1材料1.1受試藥物TTF

5、為淺黃色粉末結晶，由本校中藥化學教研室提供，含量90%以上。1.2病毒鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強陽性血清,采自上海麻鴨,-70保存。1.3試劑DSAR，廣州市新港化工；-32P-Dtp北京福瑞生物技術工程公司；缺口翻譯藥盒普洛麥格公司(Prega.)；SephadexG-50Fill；PVP瑞典Pharaia公司；SDS西德erk公司；魚精DNA，牛血清白蛋白均購自中國科學院生物物理所；硝酸纖維素膜0.45Aersha公司。1.4儀器BP211D萬分之一克電子天平德國賽多利斯；酶標儀奧地利SUNRISE；微量加樣器法國Gilsn；BifugeStrats高速低溫離心機德國Her

6、aeus；座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。1.5陽性對照藥拉米夫定3T，葛蘭素威康制藥公司，B008923。1.6動物1日齡北京鴨,購自北京前進種鴨動物飼養(yǎng)常2方法及結果2.1TTF抗鴨乙肝病毒實驗2.1.1鴨乙型肝炎病毒感染1日齡北京鴨,經腿脛靜脈注射上海麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清,0.2l/只,在感染后7d取血,別離血清,-70保存待檢。2.1.2藥物治療實驗DHBV感染雛鴨7d后隨機分組進展藥物治療試驗，每組6只,給藥組分3個劑量組，分別為75，150，300g/kg組，口服，2次/d，連續(xù)給藥10d。設病毒對照組(DHBV)，以生理鹽水代替藥物。陽性藥用3T，口服給藥

7、50g/kg，2次/d，連續(xù)給藥10d。在感染后第7天即用藥前(T0)，用藥第5天(T5)，用藥第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，別離血清，-70保存待檢。2.1.3檢測方法取上述待檢鴨血清，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA程度的動態(tài)。按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標記DHBV-DNA探針，并作鴨血清斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，在酶標檢測儀測定D值(濾光片為490n)，計算血清DHBV-DNA密度，以雜交斑點D值作為標本DHBV-DNA程度值。將每組鴨用藥后不同時間(T5、T10)和停藥后第3天(P3)血清DHBV-DNA程度與同組給藥前(T0)D值

8、比擬，采用配對t檢驗，分析差異的顯著性，判斷藥物對病毒感染的抑制效果。按公式計算每組鴨用藥后不同時間(T5，T10)和停藥第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制率%,并作圖,比擬各組鴨血清DHBV-DNA抑制率的動態(tài)。DNA抑制率%給藥前T0D值-給藥后T5，T10，P3D值給藥前T0D值100%將給藥治療組不同時間DHBV-DNA抑制率分別與病毒對照組一樣時間DHBV-DNA抑制率比擬，采用成組t檢驗，作統(tǒng)計學處理，計算t、P值，分析差異的顯著性，判斷藥效。2.2結果2.2.11日齡北京鴨感染DHBV后，血清DHBV-DNA動態(tài)DHBV-DNA感染鴨口服生理鹽水后DHBV-DNA斑點雜交結

9、果見圖1。實驗感染鴨30只血清DHBV-DNA全部陽性。病毒對照組6只雛鴨感染后第7天血清DHBV-DNA全部陽性,實驗全程21d內血清DHBV-DNA程度感染后根本平穩(wěn)。全程不同時間血清DHBV-DNA有所波動,感染后和給予生理鹽水治療10d血清DHBA-DNA程度無顯著差異。2.2.2對DHBV感染鴨血清DHBV-DNA的影響結果說明，TTF低劑量組在給藥第10天和停藥后3d與給藥前(T0)比擬計算抑制率，配對分析比擬，有顯著性和非常顯著性意義P0.050.01。成組比照,無統(tǒng)計學意義；中劑量組在給藥后第5，10天及停藥后3d(P3)，配對分析，都有顯著性意義(P0.05)。成組分析，無統(tǒng)

10、計學意義；高劑量組在給藥后第10天(T10)與給藥前(T0)比擬計算抑制率，配對分析，有非常顯著性意義(P0.01)。鴨血清DHBV-DNA程度與病毒對照組比擬，在給藥第10天T10，成組分析，有顯著性意義(P0.05)；3組均未見反跳現(xiàn)象?？诜栃运?T50g/kg，結果說明給藥第5，10天(T5，T10)鴨血清DHBV-DNA程度D值與給藥前(T0)作配對分析比擬，及給藥后血清DHBVDNA抑制率與病毒對照組作成組分析，均有非常顯著性差異P0.01。但停藥后3dP3給藥組鴨血清DHBVDNA程度D值與給藥前(T0)比擬，有反跳現(xiàn)象。結果見表12和圖2。表1TTF對鴨血清DHBV-DNA程度

11、的影響略表2TTF鴨血清DHBV-DN程度抑制率的影響略3討論國內外學者目前普遍采用DHBV感染13日齡雛鴨建立乙型肝炎動物模型,其病毒血癥持續(xù)時間較長且較穩(wěn)定,無明顯的自然轉陰現(xiàn)象,是研究人類乙型肝炎發(fā)病機制,病毒復制過程及挑選有效治療藥物的理想動物模型。鄭氏5研究了藤茶總黃酮體外抗乙型肝炎病毒HBV作用，結果說明體外對HBsAg、HBeAg和HBV-DNA有明顯的抑制效果。筆者應用1日齡北京雛鴨經腿脛靜脈注射DHBV-DNA陽性血清的方法來建立乙型肝炎動物模型,觀察從藤茶中提取出TTF的抗病毒作用,結果顯示TTF低、中、高劑量組給藥后均有一定的抑制鴨血清DHBV-DNA程度的作用P0.050.01，且停藥后3d檢測結果說明TTF沒有反跳現(xiàn)象。為開發(fā)TTF為治療乙型肝炎的新藥提供實驗根據(jù)。【參考文獻】1中國科學院植物研究所中國高等植物圖譜補編，第2冊.北京:科學出版社,1983:342.2廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所廣西藥用植物名錄.南寧: