1、酸奶生產(chǎn)系統(tǒng)中微生物檢驗點及評價標(biāo)準(zhǔn)（以酸奶生產(chǎn)為例）產(chǎn)品生產(chǎn)工藝描述酸奶是以新鮮的牛奶為原料經(jīng)過巴氏殺菌后再向牛奶中添加有益菌（發(fā)酵劑），經(jīng)發(fā)酵后，再冷卻灌裝的一種牛奶制品。按照是否加糖，酸奶可分為淡酸奶和加糖酸奶兩種， 我國常見的酸奶制品是加糖酸奶，即在制作酸奶的原料乳中加入一定量的白糖進(jìn)行發(fā)酵得到的酸奶產(chǎn)品。酸奶營養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)和鈣質(zhì)較鮮乳更易消化吸收，抑制腐敗細(xì)菌的繁殖， 降低腸道內(nèi)毒素濃度。酸奶內(nèi)含乳酸菌并在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸及族維生素等，能增強(qiáng)消化，促進(jìn)腸道蠕動和機(jī)體物質(zhì)的代謝， 提高人的免疫力，長期飲用即可保證鈣質(zhì)的需求 ，又可健 腸胃，是一種對人體腸胃非常有益的保健食品。酸奶

2、的生產(chǎn)工藝1）凝固型酸奶生產(chǎn)工藝流程原料奶驗收-標(biāo)準(zhǔn)化-均質(zhì)-殺菌-冷卻-接種-攪拌-灌裝封口-發(fā)酵-冷卻- 后熟-凝固型酸乳2）攪拌型酸奶生產(chǎn)工藝流程原料奶驗收-標(biāo)準(zhǔn)化-均質(zhì)-殺菌-冷卻-發(fā)酵-攪拌-灌裝封口-冷藏后熟-攪 拌型酸乳T果料、香精前者先冷卻，分裝后培養(yǎng)發(fā)酵。后者先冷卻接種，發(fā)酵后分裝。凝固型酸乳用于純酸奶的生產(chǎn)， 攪拌型酸乳還可用于果味、 果料等花色品種酸奶的生 產(chǎn)。一般凝固型純酸奶要有良好的組織狀態(tài)， 要防止有裂紋出現(xiàn)，因此要先攪拌分裝再發(fā) 酵。帶有果料的酸奶影響乳酸菌的發(fā)酵， 不能保持良好的組織狀態(tài)，故采用先發(fā)酵后攪拌 加果料的方式。操作要點1）原輔料驗收（1）原料乳驗收原

3、料奶必須符合 GB19301 2010食品安全標(biāo)準(zhǔn)生乳規(guī)定的各項要求，嚴(yán)格進(jìn)行感官、理化、微生物等指標(biāo)的檢驗，驗收原料奶單位必須具備生鮮乳收購許可證，每批原料驗收包括：感官、酒精、密度、脂肪、蛋白質(zhì)、冰點、非脂乳固體、抗生素以及摻 假檢測。定期監(jiān)測致病菌、重金屬、黃曲霉等指標(biāo)。(2)凈乳收購站對驗收合格的生乳用180目雙聯(lián)過濾器可去除生乳中的細(xì)小污物，操作簡單方便。(3)冷藏若不能及時加工，采用板式換熱器將過濾后的牛乳冷至24C,泵入儲奶罐暫存，但不得超過2 4 h 。(4)輔料驗收根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對輔料進(jìn)行驗收，驗收項目可包括：感官、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、查驗供 方檢驗報告、生產(chǎn)許可標(biāo)識、微生物等指

4、標(biāo)。2)配料選擇符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的各種原輔料如牛乳、乳粉、砂糖和穩(wěn)定劑等。稱料、拌料、配料 必須準(zhǔn)確計量，與原料攪拌均勻，實現(xiàn)溫度和時間的良好控制。乳粉、砂糖混合后加 5060c溫水溶解。瓊脂、明膠等穩(wěn)定劑可與少量糖混合，加 水、加熱充分溶解后添加。2)均質(zhì)均質(zhì)的目的是防止脂肪上浮使脂肪微?；纳瓶诟?。一般采用高壓均質(zhì)機(jī)， 均質(zhì)工藝條件：均質(zhì)前應(yīng)先將混合料預(yù)熱至5060C,均質(zhì)壓力為)殺菌、冷卻殺菌的目的： 除去原料乳中的氧，降低氧化還原反應(yīng)，能夠明顯促進(jìn)乳酸菌的生 長。由于蛋白質(zhì)的變性改善了牛乳的硬度與組織狀態(tài)，能夠有效防止乳清分離。殺菌及冷卻的條件：殺菌條件90C、15min。經(jīng)殺菌后的混合料

5、冷卻到 4045c備用。 還可以采用高溫瞬時殺菌，即135140c加熱23秒左右。這樣有利于營養(yǎng)成分的保存，又減少了煮沸氣味。4)乳酸菌發(fā)酵劑的制備 酸奶常用的乳酸菌發(fā)酵劑常將菌種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合用作發(fā)酵齊山二者的菌株配比為 2:11:1。發(fā)酵劑的制備首先將購買的發(fā)酵劑或保藏的菌種活化，制成母發(fā)酵劑，檢驗合格后，將母發(fā)酵劑放大培養(yǎng)，制作中間發(fā)酵劑，檢驗合格后，進(jìn)一步放大培養(yǎng)制成工作發(fā) 酵劑。 工藝條件及接種量選用處于對數(shù)期的種子液接種，一般接種量為%主發(fā)酵溫度為4245C,時間為。通常，低產(chǎn)酸力的發(fā)酵劑接種量要多，高產(chǎn)酸力的發(fā)酵劑接種量要少。一般低接種量按%高接種量按 %A上，最

6、適接種量為 %主發(fā)酵溫度采用4245C,這是保加利亞 乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合后的最適生長溫度。生產(chǎn)中，我們要注意控制好三個因素：接種量、發(fā)酵劑活性和培養(yǎng)溫度。5)發(fā)酵條件的控制灌裝或分裝完成后，應(yīng)迅速入發(fā)酵室發(fā)酵，在4243 c條件下發(fā)酵4h,以奶液達(dá)到凝固狀態(tài)為準(zhǔn)。此時酸度，pH低于。此時，需迅速轉(zhuǎn)移至26c的冷庫中存放12h防止過酸，促進(jìn)芳香物質(zhì)產(chǎn)生，并增加制品的粘稠度。6)發(fā)酵終點的判斷酸奶發(fā)酵時，指示終點的條件是組織狀態(tài)為凝固狀態(tài)，沒有過多乳清分離現(xiàn)象。7)冷卻灌裝發(fā)酵好的酸奶通過冷卻系統(tǒng)將產(chǎn)品冷卻至25C以下，組織狀態(tài)正常即可進(jìn)行灌裝。果料、花瓣酸奶可在灌裝前加入果料、果汁或花瓣。灌

7、裝前要對灌裝機(jī)、輸送帶清洗殺菌、包裝材料必須衛(wèi)生無污染。灌裝過程中要防止 交叉污染，確保灌裝過程衛(wèi)生。8)冷藏與后熟在26c冷藏，4872h產(chǎn)品后熟后即可銷售。產(chǎn)品生產(chǎn)系統(tǒng)中微生物檢驗點及評價標(biāo)準(zhǔn)3.2.1原料奶驗收的微生物檢測1)收購原料奶中菌落總數(shù)的檢測根據(jù)發(fā)達(dá)國家的調(diào)查，一般鮮奶中不可避免的細(xì)菌數(shù)是102103cfu/mL ;在極其嚴(yán)格的無菌操作下， 用機(jī)器擠出的奶的細(xì)菌總數(shù)為 104cfu/mL ,對鮮奶的影響較??；但原料奶 受到污染，細(xì)菌總數(shù)達(dá)到106107cfu/mL時，鮮奶就會出現(xiàn)令人覺察或檢出的缺陷。 這是 導(dǎo)致奶產(chǎn)品變質(zhì)的直接原因。變質(zhì)產(chǎn)品表現(xiàn)為產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、變粘或同時產(chǎn)酸產(chǎn)氣

8、、蛋白熱穩(wěn)定性下降或呈粥樣，帶 苦味、嚴(yán)重異味，不論對消費者的健康還是產(chǎn)品的市場形象都是危害最大的。同時，細(xì)菌 總數(shù)高，其中的致病菌可產(chǎn)生非常耐熱的毒素，這些毒素經(jīng)超高溫處理后仍有少量殘留， 消費者飲用后，會導(dǎo)致中毒。大量細(xì)菌繁殖會加速產(chǎn)酸，從而引起原料奶酸度增加，蛋白 質(zhì)熱穩(wěn)定性下降。國外對原料奶細(xì)菌總數(shù)衛(wèi)生指標(biāo)控制十分嚴(yán)格，荷蘭鮮奶的收購標(biāo)準(zhǔn)中要求細(xì)菌總數(shù)小于X 10 5cfu/mL ;在瑞士細(xì)菌總數(shù)超過 105cfu/mL將被降低奶款，甚至拒付 奶款；歐共體1993年規(guī)定液態(tài)奶制品的原料奶細(xì)菌總數(shù)不能超過105cfu/mL。因此，在酸奶生產(chǎn)中，原料乳中微生物總數(shù)的測定對產(chǎn)品的質(zhì)量控制尤為

9、重要。本文參照GB設(shè)計了原料奶中菌落總數(shù)的檢測方法。(1)實訓(xùn)目的掌握原料奶中菌落總數(shù)的檢測方法；熟悉原料奶驗收時微生物的指標(biāo)的檢測與控制。(2)實訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、平皿、無菌刀、三角瓶、大試管、 吸量管、酒精燈(3)實訓(xùn)步驟 培養(yǎng)基制備營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方：牛肉膏1g、酵母膏2g、蛋白月東5g、NaCL5g加水定容至1000ml,調(diào)PH為。分裝后按照 %勺添加量加入瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基， 于121c高壓滅菌 20min。樣品采集與預(yù)處理a.樣品采集以無菌刀、勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，放入滅菌容器內(nèi)，立即送檢，如條件不許可時，最好不超過4h,送檢樣時

10、應(yīng)注意冷藏。b.樣品的預(yù)處理無菌條件下打開采樣容器的瓶口，將樣品充分混勻，且瓶口經(jīng)火焰滅菌后，稱取25g (或吸取25ml)檢樣，放入裝有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，振搖 混勻，得10-1的樣品稀釋液。再按照圖3-1所示進(jìn)行梯度稀釋， 分別制得10-1、10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6、10-7 的樣品稀釋液。圖3-1樣品梯度稀釋液的制備 傾注平板 根據(jù)原料奶的污染情況，分別吸取 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、 10-7不同稀釋梯度的木品稀釋液各 1mL加到已滅菌的平皿中，再將融化后已經(jīng)冷卻至 45C 左右但尚未冷凝的固體培養(yǎng)基傾注入平皿，

11、 然后迅速轉(zhuǎn)動平皿，將培養(yǎng)基和菌液混合均勻。菌落計數(shù) 待傾注好的平板完全凝固后，倒置，于3035c培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 722ho培養(yǎng)完成后，取出培養(yǎng)皿，肉眼觀察，必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落 數(shù)。以菌落形成單位 (colony forming units , CFU表示。選取菌落數(shù)在 10 CFLH150 CFU 的平板，作為有效梯度的記錄數(shù)，當(dāng)菌落蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應(yīng)采用三個平板的平均數(shù)。(4)實訓(xùn)結(jié)果與報告計算三個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)的計算結(jié)果。若所有平板上菌落數(shù)均大于150 CFU則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄

12、為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。若所有平板上菌落數(shù)均小于10 CFU則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。若所有稀釋度平板均無菌落 生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算；如為原液，則以小于1計數(shù)。菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入”原則修約， 采用兩位有效數(shù)字報告。 菌落數(shù)大 于或等于100時，前3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以 CFU/mL為單位報告。(5)實訓(xùn)注意事項營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基一般按照 %勺添加

13、量加入瓊脂粉，若在夏天或環(huán)境溫度較高時 也可適當(dāng)增加至 %若用瓊脂條代替瓊脂粉，一定要將瓊脂條充分融溶后再分裝，否則， 瓊脂分散不均勻?qū)⒂绊懢w生長以及菌落分布。樣品梯度稀釋時，要用 %勺生理鹽水或者 PBS緩沖液進(jìn)行稀釋，若用無菌水代替， 易使菌體細(xì)胞滲透壓急速下降而造成細(xì)胞破裂，使計數(shù)結(jié)果偏低。 傾注平板時，一定要等熔融的培養(yǎng)基溫度降至45c以下(不燙手)時，方可傾注，否則，培養(yǎng)基溫度過高易將菌體熱致死，也將使計數(shù)結(jié)果偏低。傾注平板后要迅速轉(zhuǎn)動平板，在培養(yǎng)基凝固前趁機(jī)將菌液和培養(yǎng)基充分混勻，否 則，菌落生長成片，影響計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 計數(shù)時，平板上的大小菌落均要計算在內(nèi)。2)原料奶中的芽

14、抱總數(shù)及耐熱芽抱總數(shù)原料奶中通常既含有細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞，也含細(xì)菌的芽抱。形成芽抱的有芽抱桿菌、梭狀芽抱桿菌、芽抱乳桿菌、脫硫胎狀菌和芽抱八疊球菌 5個屬。原料奶中常見的芽抱桿菌 屬有：枯草芽抱桿菌、地衣形芽抱桿菌、蠟狀芽抱桿菌等。它們的適宜生長溫度為 20c 40C,最高生長溫度可達(dá) 55Co這類細(xì)菌廣泛存在于牛舍和飼料中，其芽抱體對熱和干 燥具有較強(qiáng)的抵抗力。原料奶中芽抱桿菌、梭狀芽抱桿菌和嗜冷菌等細(xì)菌所產(chǎn)生的芽抱在超高溫滅菌后仍能 存活，并導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗，所以，雖然國標(biāo)并未將芽抱總數(shù)檢測規(guī)定為必檢項目，它卻是酸 奶生產(chǎn)企業(yè)在原料奶驗收時嚴(yán)格保障產(chǎn)品質(zhì)量的一項重要檢測項目。將原料奶在80c條件下

15、加熱10min,可殺死絕大多數(shù)微生物的營養(yǎng)細(xì)胞,僅有少數(shù)耐熱細(xì)菌的芽抱存活。使用熱處理的原料奶直接作細(xì)菌總數(shù)的測定就可測出原料奶的芽胞 總數(shù)。(1)實訓(xùn)目的掌握原料奶中芽抱及耐熱芽抱總數(shù)的檢測方法；明確原料奶中芽抱及耐熱芽抱總數(shù)檢驗的意義。(2)實訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、平皿、無菌刀、三角瓶、大試管、 吸量管、酒精燈、恒溫水浴鍋、穩(wěn)定計(3)實訓(xùn)步驟 培養(yǎng)基制備營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方：牛肉膏 1g、酵母膏2g、蛋白月東5g、NaCL5g加水定容至1000ml,調(diào)PH為。分裝后按照2%勺添加量加入瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基，于 121c高壓滅菌 20min。芽抱總數(shù)測定a.以無

16、菌刀、勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，放入滅菌容器內(nèi)，立即送檢。b.用10ml滅菌吸管吸取5ml奶樣加入滅菌試管中。在另一支試管加入與奶樣等量的 水。在裝水的試管中插一支溫度計。c.將裝有奶樣和水的試管同時放入熱水中(在電爐上用白瓷缸把水煮至有小氣泡時)。直至“裝水試管”的溫度達(dá)到80C,計時10分鐘。分鐘后，取出試管，用冷水沖，使含奶樣的試管冷卻。用1ml滅菌吸管分別吸1ml冷卻后的奶樣于兩個滅菌平皿中。e.及時將冷卻至46c的營養(yǎng)瓊脂注入平皿約 15ml,并轉(zhuǎn)動平皿使之混勻；同時將營 養(yǎng)瓊脂分別注入加有 1ml滅菌生理鹽水的平皿和另一個滅菌的空白平皿內(nèi)，做空白對照。f.待營養(yǎng)瓊脂凝固

17、后，翻轉(zhuǎn)平板。置于361C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 722h,取出計數(shù)。耐熱芽抱總數(shù)測定a.用10ml滅菌吸管吸取5ml奶樣加入滅菌試管中。在另一支試管加入與奶樣等量的 水，在裝水的試管中插一支溫度計。b.將裝有奶樣和水的試管同時放入沸水浴中(在電爐上用白瓷缸把水煮沸，并保持沸騰)。直至“裝水試管”的溫度達(dá)到100C, 11時10分鐘。分鐘后，取出試管，用冷水沖，使含奶樣的試管冷卻。用1ml滅菌吸管分別吸1ml冷卻后的奶樣于兩個滅菌平皿中。d.及時將冷卻至46c的營養(yǎng)瓊脂注入平皿約 15ml,并轉(zhuǎn)動平皿使之混勻?qū)I；同時將營養(yǎng)瓊脂分別注入加有 1ml滅菌生理鹽水的平皿和另一個滅菌的空白平皿內(nèi)，做空白對照

18、。e.待營養(yǎng)瓊脂凝固后， 翻轉(zhuǎn)平板。置于551C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4872h,取出計數(shù)。（4）實訓(xùn)結(jié)果與報告計算三個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計算。若所有平板上菌落數(shù)均大于 150 CFU則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可 記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。若所有平板上菌落數(shù)均小于10 CFU則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。若所有稀釋度平板均無菌落 生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算；如為原液，則以小于 1計數(shù)。（5）實訓(xùn)注意事項若用瓊脂條代替瓊脂粉，一定要將瓊脂條充分融溶后再分裝，否則，瓊脂分散不 均勻?qū)⒂绊懢w生長以及菌落分布。耐

19、熱芽抱總數(shù)測定時，樣品需在沸水浴中達(dá)到100C,如果水不到100c就沸騰，則等候時間需延長；或在水中加入鹽以提供高沸點溫度，但要避免奶樣沸騰。傾注平板時，培養(yǎng)基溫度也不宜過低， 否則培養(yǎng)基凝固太快， 菌體不易分散均勻， 使長出的菌落不能均勻散開。傾注平板后要迅速轉(zhuǎn)動平板，在培養(yǎng)基凝固前趁機(jī)將菌液和培養(yǎng)基充分混勻，否 則，菌落生長成片，影響計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。發(fā)酵劑活力的測定1）以產(chǎn)酸率確定發(fā)酵劑活力向滅菌脫脂乳中加 3峨酵劑，在適宜溫度下（42C）培養(yǎng)小時，滴定其酸度。以乳 酸酸度值來表示發(fā)酵劑活力。稱取10 g （精確到g ）已混勻的試樣，置于 150 mL錐形瓶中，力口 20 mL新煮沸冷

20、卻至室溫的水，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液電位滴定至pH為終點；或于溶解混勻后的試樣中加入mL酚酬:指示液，混勻后用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，并在 30 s內(nèi)不褪 色，記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)，代入下面公式中進(jìn)行計算。試樣中的酸度數(shù)值以（T）表示，按下式計算：c XV X 100X =Xm x 式中：X一試樣的酸度，單位為度（T）;c 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，單位為摩爾每升（ ml/L ）;滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（ mD；m試樣的質(zhì)量，單位為克（g）;酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度，單位為摩爾每升（ ml/L）。相當(dāng)于乳酸（90% 的量在重復(fù)性條件下獲得的兩

21、次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù) 字。并非活力越強(qiáng)發(fā)酵劑質(zhì)量越好，酸度應(yīng)控制在范圍內(nèi)，其中最佳，發(fā)酵劑活力與 最佳接種量的關(guān)系可參考如下參數(shù)：活力大于時，接種量活力在時，接種量活力在時，接種量活力在時，接種量 %活力小于的發(fā)酵劑不適于在酸奶生產(chǎn)中使用。2）刃天青還原法將1毫升發(fā)酵劑加入9毫升滅菌脫脂乳中，并加 刈天青溶液1毫長，36.7 C保溫30 分鐘后開始檢查，其后每 5分鐘觀察一次結(jié)果，淡粉紅色為終點。活力好的發(fā)酵劑應(yīng)在 35分鐘內(nèi)還原丸天青。5060分鐘還原的發(fā)酵劑不宜使用，對照的不含發(fā)酵劑空白滅菌脫脂乳的還原時間不應(yīng)少于4小時。3）以凝乳時間判斷發(fā)酵劑活力稱取一定量

22、的脫脂乳粉，配制成12%勺復(fù)原乳，然后蒸煮15min,或者118C、15min進(jìn)行高壓滅菌處理。復(fù)原乳冷卻至接種溫度后，按照2%勺接種量接入待測發(fā)酵劑，混合后在待測菌種的最適溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄凝乳時間。 凝乳時間越長，表明發(fā)酵劑的活力越差，凝乳越快，表明發(fā)酵劑活力越強(qiáng)。酸奶生產(chǎn)監(jiān)測中，性能優(yōu)良的發(fā)酵劑按照 一定的接種量，凝乳時間一般控制在3h,可據(jù)此判斷新的一批發(fā)酵劑的活力是否能夠達(dá) 到實際投產(chǎn)的要求。該法簡便易行，不需試劑與繁瑣的檢測設(shè)備，也不破壞樣品的組織結(jié)構(gòu)，但需要連續(xù)觀察，較費時，且有一定的主觀差異性。發(fā)酵劑純度的測定（1）實訓(xùn)目的熟練掌握鏡檢法簡單快速地判斷酸奶發(fā)酵劑的純度；

23、進(jìn)一步熟悉革蘭氏染色的操作過程及顯微鏡的使用。（2）實訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種針、滴瓶（帶膠頭滴管） 、 三角瓶、棉塞、滴管、大試管（3）實訓(xùn)步驟種子發(fā)酵劑的采樣與預(yù)處理以無菌勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，無菌條件下將樣品充分混勻，且瓶口經(jīng)火焰滅菌后，稱取 10g （或吸取10ml）檢樣，放入 裝有90ml滅菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，振搖混勻，得10-1的樣品稀釋液。樣品的革蘭氏染色a.涂片 用移液槍吸取10ul已稀釋好的樣品液滴在載玻片的中央，用燒紅冷卻后的接種環(huán)將液滴涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。b.干燥與固定 將涂布樣品面向上，小心地在酒精燈上

24、高處微微加熱，使水分蒸發(fā) 完全后，在酒精燈火焰處盡快的來回通過2-3次，共約2-3秒種，不覺過燙為宜（不超過60 C）,放置待冷后，進(jìn)行染色。c.初染 在涂片薄膜上滴加草酸鏤結(jié)晶紫1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min后，水洗去除表面的結(jié)晶紫，至洗下的水呈無色為止。d.媒染 用移液槍吸取約300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆蓋涂片，染色約 1min后，再次水洗。e.脫色 斜置載玻片，滴加 95%乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20-30S ,隨即水洗。f.復(fù)染 在涂片薄膜上滴加番紅染液 1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min后水 洗至洗下的水呈無色。 鏡檢 取制好的玻片

25、用吸水紙吸掉水滴，將載玻片晾干或吹干后置顯微鏡下觀察， 先用低倍鏡觀察，確定染色區(qū)及目標(biāo)視野后滴一滴香柏油在玻片上，再用油鏡觀察細(xì)菌的顏色及細(xì)胞形態(tài)。(4)實訓(xùn)結(jié)果與報告酸奶發(fā)酵劑中正常的乳酸菌是革蘭氏陽性菌，鏡檢為紫色，呈球狀或桿狀，若有其他形態(tài)的菌株，可疑似為污染的雜菌，需進(jìn)一步鑒定，方可投產(chǎn)。(5)實訓(xùn)注意事項涂片時，不宜取樣過多，且不可涂布面積過大，否則，菌樣過于分散，不易觀察。將菌樣蒸干與固定時，切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形，影 響菌體形態(tài)的觀察與判斷。脫色時間不宜過長，否則可能使菌體脫色過度，鏡檢時看不到明顯的紫色菌體。3.2.4成品的微生物指標(biāo)檢測1)乳酸菌活菌

26、計數(shù)酸奶中乳酸菌的含量是評價產(chǎn)品對人體營養(yǎng)與健康作用的重要指標(biāo)，新的酸奶國家標(biāo)準(zhǔn)中(GB/)規(guī)定市售酸奶中的乳酸菌活菌數(shù)不得低于1xi06cfu/mL。作為保健食品的酸奶，應(yīng)突出乳酸菌并保持一定的活菌數(shù)， 若成品中乳酸菌活菌數(shù)較少， 則達(dá)不到酸奶制品 應(yīng)有的功效。由于酸奶中乳酸菌活菌的數(shù)量直接影響著產(chǎn)品的質(zhì)量，所有乳酸菌活菌計數(shù)成為判斷產(chǎn)品是否合格的重要指標(biāo)，也是生產(chǎn)中成品檢驗必不可少的一項。乳酸菌的活菌計數(shù)：采用 MRSW養(yǎng)基傾注培養(yǎng)法，于 42c厭氧條件下培養(yǎng) 2-3d后計 數(shù)。(1)實訓(xùn)目的掌握酸奶中乳酸菌活菌數(shù)的檢測方法；了解酸奶中乳酸菌活菌數(shù)測定的意義。(2)實訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈

27、工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、平皿、無菌刀、三角瓶、大試管、 吸量管、酒精燈(3)實訓(xùn)步驟培養(yǎng)基制備 MRS培養(yǎng)基配方：蛋白月東10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、 乙酸鈉5g、檸檬酸氫二鏤 2g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂、硫酸鎰、吐溫 801mL加水定容 至1000ml, PH自然。分裝后按照 2%勺添加量加入瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基，于 121c高 壓滅菌20min。樣品預(yù)處理a.樣品采集 以無菌刀、勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，放入滅菌容器內(nèi)，立即送檢，如條件不許可時，最好不超過4h,送檢樣時應(yīng)注意冷藏。b.樣品的預(yù)處理無菌條件下打開采樣容器的瓶口，將樣品充分混勻，且瓶口經(jīng)火焰滅菌后，稱取25g (或吸取25ml)檢樣，放入裝有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，振搖 混勻，得10-1的樣品稀釋液。再按照圖3-1所示進(jìn)行梯度稀釋， 分別制得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 的樣品稀釋液。傾注平板 根據(jù)原料奶的污染情況，分別吸取 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、 10-7不同稀釋梯度的木品稀釋液各 1mL加到已滅菌的平皿中，再將融化后已經(jīng)冷卻至 45C 左右但尚未冷凝的固體培養(yǎng)基傾注入平皿， 然后迅速轉(zhuǎn)動平皿，將培養(yǎng)基和