1、Western-Blot操作流程試劑配制蛋白提取試劑1.RIPA裂解液：10mMTris（，）1%NP40%TritonX-100脫氧膽酸鈉2mMEDTA1mMPMSF20%甘油調pH值至?；靹蚝蟊Ａ簦L久保留于-20。使用時，加入蛋白酶控制劑cooktail。工作液制膠用（1-6）：1.LTrisHCl（）Tris12.114g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調pH至），室溫下保留。2.LTris（）Tris18.671g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調pH至），室溫下保留。3.10SDSSDS10g蒸餾水至100ml如溶解困難，可在水浴下溶解，室溫保留。如在長久保留中出現(xiàn)積淀，水浴溶

2、化后，仍可使用。4.10過硫酸胺（AP）過硫酸胺蒸餾水1ml（現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過硫酸胺干粉稱好重量后放在管中，一次性多裝幾管，使用時加入蒸餾水水即可，溶解后，4保留，保留時間為1周）5四甲基乙二胺原液（：保留。630%丙稀酰胺：4?C保留。10%基層膠，即分別膠（兩塊膠，15ml膠的濃度依照自己所做蛋白的大小確定依次加入去離子水30%丙烯酰胺5ml1.5MTris-HCl（）10%SDS150l10%AP150lTEMED6l每加一種成分隨即搖勻，為了加速凝膠，能夠將過硫酸胺和TEMED量加大，依照實驗當時的溫度適合調整，加入TEMED勻后應立刻灌膠。灌膠后加異丙醇（1ml）消泡5%上層膠（兩

3、塊膠，6ml依次加入去離子水30%丙烯酰胺1ml1MTris-HCl（）10%SDS60l10%AP60lTEMED6l每加一種成分隨即搖勻，為了加速凝膠，能夠將過硫酸胺和TEMED量加大，依照實驗當時的溫度適合調整，加入TEMED勻后應立刻灌膠。75X電泳液緩沖液Tris（）15.1g甘氨酸（）94gSDS5.00g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保留,用時稀釋倍，過去取160ml配制成800ml即可。810X轉膜緩沖液甘氨酸（）Tris（）30.3g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保留,用時稀釋倍，并加入甲醇至20%。過去取80ml母液，加560ml蒸餾水，最加160ml甲醇，配制成800ml

4、即可。（先加甲醇易產(chǎn)生積淀）910XTBS緩沖液Tris（）24.2gNaCl80.0g蒸餾水至1000ml（濃鹽酸調pH至），溶解后室溫保留。101XTBST緩沖液10XTBS緩沖液100ml蒸餾水900mlTween-201ml因比較粘稠，應遲緩吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防備產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫保留。11關閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶)：1XTBST緩沖液95-100ml脫脂奶粉5g溶解后4保留，可于一周內使用。步驟：SDSPAGE電泳（1）沖洗玻璃板：兩面都擦洗事后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗潔凈后立在筐里晾干。（2）灌膠與上樣、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。爾后垂直卡在架子上準備灌膠。、

5、按前面方法配基層膠（15ml，兩塊膠，每塊膠在7ml左右），加入D立刻搖勻即可灌膠。灌膠后膠上加一層異丙醇醇（1ml左右），液封后的膠凝的更快。、當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。棄去異丙醇，用水沖洗，并用吸水紙將水吸干。、等待膠凝時期可計算含10-100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（依照自己的實驗需要進行選擇，沒有固定的量）取出上樣樣品至EP管中，加入上樣緩沖液至終濃度均為1。上樣前要將樣品于開水中煮5-10min使蛋白變性。、按前面方法配5的上層膠（6ml，兩塊膠）,加入TEMED后立刻搖勻即可灌膠。將節(jié)余空間灌滿濃縮膠爾后將梳子插入濃縮膠中（從梳子的一頭開始插）。灌膠時也要使膠沿

6、玻璃板流下免得膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝集時體積會收減少小（也提示膠已經(jīng)凝集），進而使加樣孔的上樣體積減小，所以在上層膠凝集的過程中要在兩邊補膠（不補膠問題也不大）。等待上層膠凝集時期配制1電泳緩沖液。1電泳緩沖液，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。*電泳緩沖液必然要加至高出玻璃板的上緣（量要足夠多），否則電泳時期會出現(xiàn)電流過低的現(xiàn)象，進而影響電泳的收效。、上樣Marker7l樣本依照自己的樣品決定實驗所用Thermo26619#Marker電泳后出現(xiàn)9條帶：10，55，70，250KDa（詳細條帶數(shù)目會由于膠的濃度不同樣而不同樣），最少4條帶（6%的分別膠時

7、出現(xiàn)70，250KDa）。（3）電泳：開始恒壓，電壓80V，電泳跑到分別膠此后可調治電壓到120V電泳至溴酚蘭剛跑出即可停止電泳，進行轉膜（一般要讓目的條帶跑過分別膠的1/3比較好）。電泳結束前20分鐘配制1X轉膜緩沖液。（四）轉膜（1）轉一張膜需準備張濾紙和1張硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時必然要戴手套（由于手上的蛋白會污染膜）泡激活，后和濾紙置于1X轉模緩沖液浸潤。（2）夾子黑的一面：海綿-2張濾紙-膠-PVDF膜-2張濾紙-海綿（次序必然注意）將夾子翻開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒往返搟幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊二層濾紙，先將玻璃板撬開，隨后將濃縮膠輕輕刮去，小心剝下

8、基層膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將硝酸纖維素膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠并除氣泡。在膜上蓋2張濾紙并除掉氣泡（膜蓋下后不能再搬動）。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下即可合起夾子。要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能夠相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。假好像時做兩塊膠，轉膜的時候應記著樣本的地點。（3）將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面。電轉移時會產(chǎn)熱，故放冰來降溫。一般用恒流400mA轉膜。實質上應當依照蛋白分子量的大小確定轉膜時間，假好像時做兩塊膠，轉膜結束應在膜上做標記，以便查問相應樣本。轉膜后，膜要分正反面，轉膜時靠膠的一面為正面。轉膜結束前配制關閉液（5%脫脂牛

9、奶)及1XTBST緩沖液。若是做磷酸化抗體等，需要用血清封閉，詳細情況可參照抗體說明書。（五）免疫反響（1）關閉：將膜用移至含有關閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動關閉1-2h。（2）一抗.將一抗用關閉液稀釋至適合濃度；加入抗體，4度住宿，第二天用1XTBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。（3）二抗同上方法準備二抗稀釋液，室溫下孵育1-2h后，用1XTBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。（六）化學發(fā)光，顯影，定影（1）將和兩種試劑等量等體積混淆；翻開X-光片夾，鋪上保鮮膜，將膜正面向上放于保鮮膜上，滴加此混淆液1-3min后（見到熒光）（2）將顯影液，自來水和定影液分別到入盤中；在紅燈下取出光片，用切紙刀剪裁適合大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；把光片放在膜上，一旦放上，便不能夠搬動，關上X-光片夾，開始計時；依照信號的強弱適合調整曝光時間，一般為到5min，也可選擇不同樣時間多次壓片，以達最正確收效；曝光達成后，翻開X-光片夾